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ありがとうございました 削除/引用 No.1308-8 - 2011/12/12 (月) 16:14:15 - まりよし いろいろとお教えくださいましてありがとうございました。 280ｋDa程度のタンパクを測定するため 5％ゲルで電気泳動していたのですが、 サンプル中に含まれる60ｋDa程度の別のタンパクも 測定する必要が出てきたため、 転写後のメンブレンを上下半分に切って、 それぞれ１次抗体をかけて実験することにより、 SDSーPAGEのステップを省略できないかと考えたのです。 しかしながら、お教えいただいたように、 5％ゲルにおいては、 〜70ｋDa程度の低分子のタンパクは分子ふるいにかからず、 ほぼ一定速度でみんなまとまってフロントライン付近を 流れていくということが分かりました。 本日、複数の色がついたマーカーを使用して電気泳動を行い、 低分子領域ではマーカーがほとんど分かれず 団子状になってフロントライン辺りを流れていっているのを 確認しました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1308-7 - 2011/12/12 (月) 12:49:30 - AP 分子ふるいがない状態では、物質の電気泳動速度は、電荷に比例して速くなり、質量に比例して遅くなります。質量2、電荷2の物質より質量2、電荷4や質量1、電荷2の物質が倍速いということです。 DNAやSDS化されたタンパク質は分子量と電荷が比例するので(分子量が二倍になれば電荷も二倍)、分子ふるいがない状態では、分子量に関係なく泳動速度は一定です。分子ふるいががあると、分子量によってというより、分子のかさ高さによって移動度が変わるので分離ができるわけです。線形のDNAやSDS化されたタンパク質は、分子のかさ高さは、すなわち分子の長さになり、分子の長さは分子量に比例するので、間接的に分子量によって分離していると言いかえているわけです。 で、質問の答えは、「分子ふるいが効いていない状態では、単純に物質の質量当たりの電荷が大きい方が泳動速度が大きくなるから」 ただし、不連続バッファー系のフロントライン付近はpHが不連続であり、物質の電離度、等電点によって電荷が一定でないかもしれませんが、質問の答えとしてはあまり関係ないでしょう。

フロントライン 削除/引用 No.1308-6 - 2011/12/12 (月) 10:56:18 - まりよし 説明不足で申し訳ありません。 フロントラインとは電気泳動のときのBPBの横一直線のラインのことを 言っていました。 一般にフロントラインとは透明な線の事を指すのでしょうか? その線についてはこれまであまり注意して見ていませんでした。 （トンネルの分かりやすい説明のように） BPBは分子量が小さく、 ゲルのふるいにはかからず、 自らの分子量と電荷（というよりむしろ電荷のみ）にしたがって 移動していくのはわかりました。 ならば次のような考えでよいのでしょうか？ 例えば通常15％ゲルで流すような20ｋDa程度のタンパクを ５％ゲルで流したとき、 BPBのラインよりも先にタンパクは流れていく理由は、 「分子量はBPBの分子量のほうが小さいけれども、 電荷は20kDa程度のタンパクほうが大きいから、 5％ゲルのような低濃度のゲルで電気泳動した場合は、 分子量の大きい20kDaのタンパクのほうが先に流れていく」。 たびたび申し訳ありませんがご教示いただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1308-5 - 2011/12/09 (金) 14:27:53 - ああああ フロントラインってBPBの下の透明なラインのことですよね。 ゲル濃度を上げるとBPBとその下の透明なラインの距離って広がりませんか？ 例えば、培養上清をSDS-PAGEするとフェノールレッドはBPBの下の透明なラインと同じラインで移動しますよね。5%のゲルで泳動するとフェノールレッドとBPBはほぼ同じラインで移動しますが、15%のゲルで泳動するとフェノールレッドとBPBの距離って広がると思うんですけど、気のせいですかね？

(無題) 削除/引用 No.1308-4 - 2011/12/09 (金) 08:17:54 - う 高さが150cmのトンネルを通り抜ける時、 身長が180cmの人は、しゃがんで行かなければならない。 身長が120cmの人は、そのまま走って行くことも可能。 身長が10cmの人は、そのまま走って行くことも可能。 高さが100cmのトンネルを通り抜ける時、 身長が180cmの人は、かなりしゃがんで行かなければならない。 身長が120cmの人は、しゃがんで行かなければならない。 身長が10cmの人は、そのまま走って行くことも可能。 高さが50cmのトンネルを通り抜ける時、 身長が180cmの人は、ほふく前進しなければなければならない。 身長が120cmの人は、ほふく前進しなければなければならない。 身長が10cmの人は、そのまま走って行くことも可能。 身長が10cmの人がBPBと考えれば、自ずと答えはでるはずです。

(無題) 削除/引用 No.1308-3 - 2011/12/08 (木) 22:39:54 - AP SDS PAGEの分館範囲はおおよそ10 kDa以上ですよね。 分画範囲より小さいイオンとかBPBは分子ふるいにかからないので、ゲル濃度に関係なく、移動度は自らの分子量と電荷にのみ依存しているはずです。なので、当然のことじゃないかと思うんですが。 >当たり前ですが、ゲルの濃度が濃くなればなるほどBPBの移動度は下がるので 当たり前ですか？

(無題) 削除/引用 No.1308-2 - 2011/12/08 (木) 18:42:16 - ああああ フロントラインが落ちるとは、ゲルから抜けるということですか？ 当たり前ですが、ゲルの濃度が濃くなればなるほどBPBの移動度は下がるので、BPBとフロントラインの間は広がっていきます。

SDS-PAGEにおけるフロントラインの移動度 削除/引用 No.1308-1 - 2011/12/08 (木) 16:34:52 - まりよし SDS-PAGEでどのような分離ゲル濃度を用いても、 フロントラインの移動度が同じなのはなぜですか? 200V定電圧で電気泳動した場合、 5％ゲルでも15％ゲルでも 泳動開始後約1時間でフロントラインが落ちます。 BPBの分子量にしたがって フロントラインは移動していると思っていたのですが、 違うということですよね?

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