Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

最新のフォーラム　|　このフォーラム　|　ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

大腸菌を用いたタンパク質の発現について トピック削除
No.1302-TOPIC - 2011/12/07 (水) 10:36:28 - TEL
現在大腸菌BL21株を用いたタンパク質の発現を行なっています。
発現ベクターとしてpUC18を用いていますが, BL21株はLaqIq(-)
であるため, 結構な量の目的タンパク質が序盤から発現してしまって
います。そのためか, 非常に増殖が遅いです。コロニーつついて全培養
した場合, 濁り始めるまで約6時間くらいかかってしまいます。そこで質問
なのですが,

1.pUC系の発現ベクターを用いる場合LacIq(+)株がいいのか

2.増殖が遅いのはやはり常に目的タンパク質が発現しているためなのか
(pUC18のみを入れた場合も遅いです。pColdI等は非常に速いのですが)

※目的タンパク質は複雑な構造ではありません。EGFPに3kDa程のタンパク質
　を融合させて発現させています。コドンも調製しているので恐らく問題ない
　かと思います。

よろしくお願いします。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.1302-6 - 2011/12/07 (水) 22:21:39 - 1
lacプロモータとは逆向きに目的遺伝子を挿入。目的遺伝子の上流にT7プロモータも挿入。
上手くいくかは分かりませんが。

ありがとうございます 削除/引用
No.1302-5 - 2011/12/07 (水) 13:36:34 - TEL
>>まず、なぜpUCを選んだのか
ボスの意向です。T7プロモーターを薦めたのですが, Lacプロモーターも
普通に発現に使われていると言われ, そのままコンストラクトを作成した
次第です。完全にpUC18に固執しているようです。私自身はクローニング用
ベクターとして考えています。

>>ストレートな解決方法は、ベクター系を変えること
再度説得を試みたのですが, ホストを変更するようにとの事で現在ホスト
を探し始めました。NEBのExpress I^q Competent E.coliを検討している
のですが, 使っていらっしゃる方いるでしょうか？できれば感想をお聞き
したいです。

>>25℃くらいの低温で培養する
>>培地にグルコースを添加して、lacオペロンを抑制する
このような方法もあるのですね。ホスト変更と合わせて検討してみたいと
思います。

>>JM109など
当然JM109も検討しようと思い冷凍庫を漁ったのですが, 随分昔に使ったも
のらしく, 既に生きている状態のものはありませんでした。

(無題) 削除/引用
No.1302-4 - 2011/12/07 (水) 12:59:53 - AP
それと、
タンパク質分解酵素の欠損がひとつもないですが、JM109、XL1-Blueなんかでもタンパク質発現できますし、だいたいはタンパク質の分解が目立つということもないので、宿主を変えてみるというのも当然ありです。lacI^qはF'エピソームに乗っていたはずですから、F'+を選択したうえで使用しましょう。

(無題) 削除/引用
No.1302-3 - 2011/12/07 (水) 12:53:24 - AP
まず、なぜpUCを選んだのかが疑問です。普通はDNAのクローニングやクローニングしたDNAの増殖・精製のために使うベクターです。なにか特別な狙いがあるのでしょうか。

一般的な発現ベクターをみればわかるように、leaky expressionで大腸菌の生育や生存が悪くならないように、
・oriがColE1やpBR由来の低コピー数のものにしてある（pUCなど変異型oriをもつものはそれより10倍以上コピー数が多い）
・ベクター自体にもlacI^qが乗せてある（宿主自体が持つ野生型lacIまたはlacI^qに加えて）
というふうに対策されています（pCold然り）。
それを捨ててまでpUCを使う必然性がある実験なんですか？

ストレートな解決方法は、ベクター系を変えること。
いまのまま付け焼刃でなんとかするとしたら、
誘導をかける前、大腸菌を殖やす段階では
・25℃くらいの低温で培養する（pUCのoriは温度感受性変異なので低温ではpBR本来のコピー数に近づく）。低温だとやはり培養時間が長くなってしまいますが。
・培地にグルコースを添加して、lacオペロンを抑制する

大腸菌を用いたタンパク質の発現について 削除/引用
No.1302-1 - 2011/12/07 (水) 10:36:28 - TEL
現在大腸菌BL21株を用いたタンパク質の発現を行なっています。
発現ベクターとしてpUC18を用いていますが, BL21株はLaqIq(-)
であるため, 結構な量の目的タンパク質が序盤から発現してしまって
います。そのためか, 非常に増殖が遅いです。コロニーつついて全培養
した場合, 濁り始めるまで約6時間くらいかかってしまいます。そこで質問
なのですが,

1.pUC系の発現ベクターを用いる場合LacIq(+)株がいいのか

2.増殖が遅いのはやはり常に目的タンパク質が発現しているためなのか
(pUC18のみを入れた場合も遅いです。pColdI等は非常に速いのですが)

※目的タンパク質は複雑な構造ではありません。EGFPに3kDa程のタンパク質
　を融合させて発現させています。コドンも調製しているので恐らく問題ない
　かと思います。

よろしくお願いします。
全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。