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(無題) 削除/引用 No.13-9 - 2011/02/16 (水) 13:04:46 - 経験者 一応、テンプレートDNAの精製が不十分だとRNAができなかったことがあります。また自作のDEPC処理水を使ってダメだったこともあります。 もしpBluescriptを使っているのでしたら、M13 primerでT7,T3を含んだインサート断片を増幅して、テンプレートにする方が簡便で、調製も楽だと思います。インサートの長さとプローブとしての配列の特異性にもよりますが、不要領域の制限酵素処理による除去も不要です。

(無題) 削除/引用 No.13-8 - 2011/02/16 (水) 10:33:15 - とおりすがり in vitro transcriptionの時の水は気にされてますでしょうか。 もし自前のDEPC処理水を使っているのなら、転写効率に影響するかもしれません。DEPC水の処理が不適切だとDEPCが残留してしまいますからね。その場合、思い切ってDEPC未処理水でやってみたらどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.13-7 - 2011/02/16 (水) 01:09:12 - ノーザン 返信ありがとうございます。 ・泳動はTAE、TBEのゲルで行っております。 ・ベクター、制限酵素の確認をもう一度行ってみましたが間違っていなかったようです。 ・キットではなく製品を単品で購入していないためコントロール用のプラスミドを持っておりません。このことも原因を絞りきれない一つの原因かと思 っております。 ・私の実験は１本鎖プローブで行わなければならず、感度等の問題からRNAプローブを用いてきました。DNAプローブも検討してみようかと思います。 ・RNase inhibitorももっておらず、私の研究室ではinhibitorなしでプローブを作ってきたようなので、なしでも可能なようです。 プラスミドDNAの精製がうまくいっていないとやはりRNAプローブの収量は激減するものでしょうか（ドットブロットを行うと期待する濃度の100〜1000倍程度の濃度しか検出できず、泳動を行うとバンドは見えないがレーン全体がぼやっとすることがある）？ 何度も申し訳ありませんがよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.13-6 - 2011/02/15 (火) 00:35:45 - なつかしい たしか、In vitro transcription　の時に、 PromegaのRNasin（RNase inhibitor）を入れてました。

(無題) 削除/引用 No.13-5 - 2011/02/14 (月) 23:05:58 - AP まずないこととは思いますが、ベクターがBlueScriptだとして、SKとKSを取り違えているとか（つまり切断した制限酵素とRNA polの組み合わせが反対だとか）。 Rocheのキットを使っているなら、コントロール用のプラスミドがついてきているはずですが、それで動くかどうかは試してみましたか。 一本鎖RNAプローブでなければならない特別な理由がなければ、ランダムプライミングで作ったDNAプローブに切り替えてはどうでしょうか。これでも十分にノーザンに使えますし、ラベルの効率も鋳型を選ばず安定しています。 一本鎖プローブ（strand-specific probe)が必要なら、片側のプライマーだけいれたPCRベースで標識した、一本鎖DNAプローブを使うという手もあります。

(無題) 削除/引用 No.13-4 - 2011/02/14 (月) 22:20:01 - 泳動 >・1h程度でアガロースゲルで電気泳動 とありますが、変成アガロースゲルですか?普通のTAEもしくはTBEのゲルですか？ 簡易的に調べるのであれば、洗った直後の泳動槽を使って作りたてのTAEゲルでも問題ないですが（怒られそうですが私は手抜きでそうしてます）。

(無題) 削除/引用 No.13-3 - 2011/02/14 (月) 04:57:07 - ノーザン 返信ありがとうございます。 やはりこのような場合、RNaseによる失敗が一番考えられる原因でしょうか？ 一応使用しているプラスミドはシークエンスによる確認済みのもので精製はカラムによるゲルろ過精製でも試みてみました。 ほかに考えられる原因などもしありそうでしたら、ご教授いただけると幸いです。何度も申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.13-2 - 2011/02/14 (月) 02:45:14 - AA 電気泳動をしてバンドが見えないのなら合成できていないと考えるのが妥当かと思います。 手順自体はそれほど問題なさそうに見えます (私個人は制限酵素処理後は失活だけで精製していませんが) プラスミドは正しいものが作れていますでしょうか？ あるいはプラスミドを精製する段でRNaseを除去できていますでしょうか？ 試薬へのコンタミ等も検討してみてはどうですか？

RNAプローブのin vitro transcriptionについて 削除/引用 No.13-1 - 2011/02/14 (月) 01:47:20 - ノーザン DIGのRNAプローブについての質問です。 ノーザンをしているのですが、RNAプローブの出来がよくありません。プローブを電気泳動してもRNAのバンドが全く見えない状態です。現在の方法といたしましては、 ・プラスミドを制限酵素処理し、フェノクロ・エタ沈で精製。 ・T7もしくはT3ポリメラーゼでin vitro transcription（37℃で1〜2h）。 ・1h程度でアガロースゲルで電気泳動。 プローブを直接スポットし検出を行っても収量が悪いようなのでtranscriptionがうまくいっていないと思われます。制限酵素はxho1とxba1を用いています。 同じような現象で悩んだことのある方やRNAプローブを利用している方にご助言いただけたらと思います。どうぞよろしくお願いいたします。

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