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(無題) 削除/引用 No.1295-12 - 2011/12/12 (月) 11:52:52 - みゃ KENさん ご返答ありがとうございます。 研究は蛍光標識へ移行していますが今後の参考までにお聞かいただけませんか。 ＞リン酸がAPに影響を及ぼすのがいやなので、 リン酸はAPに影響をおよぼすのですね。知りませんでした。。 どのような影響があるのかご存知でしたら教えていただけませんか。 また、TBS-tween 20の試薬は濃度はどのくらいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1295-11 - 2011/12/10 (土) 00:30:08 - KEN 既に解決されてよかったですね。 植物組織は扱ったことはありませんが、ヒト検体の場合で。。。 H2O2はAPではなくペルオキシダーゼのブロッキングですね。 蛇足ですが、最近は、メタノールを使うのが面倒なのと時間を短縮したいのとで3% H2O2を5分ですませてしまっています。結果はあまり変わりません。 こちらの方が重要かとおもいますが、AP標識のとき、私は、洗浄液にはPBSは使いません。PBSの中のリン酸がAPに影響を及ぼすのがいやなので、PBSではなくTBSを使うようにしています。 内因性APのブロッキングとして、65℃30minくらいでTBS-tween 20の中につけたりしたこともありますが、ヒトのFFPE切片ばかりなので植物はわかりませんが、実際のところ、やらなくても大丈夫だったことの方が多いです。

(無題) 削除/引用 No.1295-10 - 2011/12/09 (金) 09:54:37 - みゃ 植物のPFA固定の論文はあります。 自分でも、固定した細胞とそうでない細胞を観察して見た目上は活性が低下しているように思えます。 結局、蛍光標識できるようになりました！！ ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1295-9 - 2011/12/09 (金) 08:14:57 - 組織 素人の疑問ですが、植物組織の固定はPFAを使うものなのでしょうか？ ホルマリンは浸透性がよくないので、細胞壁に十分浸透するのかなと疑問に思ったのですが、文献等で報告はあるのでしょうか？古い知識かもしれませんが、植物の固定にはカルノア液とかを使うイメージがあったので・・

(無題) 削除/引用 No.1295-8 - 2011/12/06 (火) 19:28:20 - みゃ 二次抗体の変更は視野に入れていますが、 予算などもろもろもありまして，できれば。。。というところです。 レバミゾールも手元にないので試してみたいのですが， 完璧ではないのですね。。。

(無題) 削除/引用 No.1295-7 - 2011/12/05 (月) 23:03:16 - AP レバミソールはつかってないんですか？ これも完璧ではないけれど。

(無題) 削除/引用 No.1295-6 - 2011/12/05 (月) 22:36:27 - ABZO APがよくないさそうなら単に他の標識の抗体に変えればいいだけではないかと思うんだがどうよ。ていうか、H2O2/メタノルってそれAPじゃなくてパーオキシデースを失活させるやつじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.1295-5 - 2011/12/05 (月) 22:22:31 - みゃ >Harmoniaさん もちろん原理から調べていこうと努力しているところです。 しかし与えられている時間がないため質問させていただいております。 ご存知の方いらっしゃいましたらよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1295-4 - 2011/12/05 (月) 22:12:35 - Harmonia ＞ たくさん出てくるのですが、多くは動物を対象とした実験を想定しているようです。 ＞ 生物の知識が乏しすぎるので、植物に対して行うにはどの手法を用いるべきなのか判断できない状況です。 A．できそうなところからやってみる。 B. 推奨されている試薬の効能でなく原理を調べる。 C. 植物の例が見つかるまで検索する。 Aは経験値アップ。Bは知識値アップ。Cはどちらもアップなし。 言うまでもないことですが、Bの効能とは「内在性アルカリホスファターゼ活性を抑える」です。

(無題) 削除/引用 No.1295-3 - 2011/12/05 (月) 20:47:03 - みゃ たくさん出てくるのですが、多くは動物を対象とした実験を想定しているようです。 生物の知識が乏しすぎるので、植物に対して行うにはどの手法を用いるべきなのか判断できない状況です。 論文の検索中ですが、 植物のIHCがなかなか見つかりません。

(無題) 削除/引用 No.1295-2 - 2011/12/05 (月) 19:51:40 - 脂肪 「内因性　アルカリフォスファターゼ」でgoogle検索したらめちゃめちゃ出てきましたよ。

IHC：内因性酵素による発色が防げない 削除/引用 No.1295-1 - 2011/12/05 (月) 18:25:39 - みゃ IHC初心者です。 植物（直径1mm以下）を用いて以下の条件でIHCを行なっています。 コントロールで発色が出てしまい困っています。 抗体を用いずに実験してみたところ、同様にコントロールで発色しました。 そのため、内因性酵素が問題であると考えています。 AP標識であることから、内因性APの除去方法を調べています。 しかし、内因性ペルオキシダーゼ除去方法の記載は多くありますが、 AP除去についてよくわかりません。 どのように検討していけばよいのでしょうか。 宜しくお願い致します。 ＜条件＞ 固定：4%PFA 凍結切片：40μm、OCTcompound・液体窒素 内因性酵素除去：0.3% H2O2/メタノール 30min 二次抗体：AP標識(Molecular probes) 発色：BCIP/NBT 10min(Sigma) ＊洗浄：各工程後PBSで10min×3回

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