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apoptosisのスタンダートについて トピック削除
No.1291-TOPIC - 2011/12/03 (土) 18:23:22 - 初めて
今年、研究室に配属された４年生です。
現在、apoptosisの抑制実験を行っており、western blottingを用いてcaspase-3の活性化を確認しているところなのですが、コントロールとしてのGAPDHが揃わなくて困っています。
サンプルは、蛋白質の定量を行ってから流し、揃わなかったらImageJを用いてアプライ量を変化させ流しているのですが全く揃いません。
原因がなにかわからなくて困っております。どなたかアドバイスをくれる方がいらしたらお願いします。
ちなみに、トランスファー装置はセミドライ式のものをもちいております。
　
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No.1291-6 - 2011/12/05 (月) 22:07:31 - kodamataro
形態学的にはどうなのでしょう。
何らかの処置をすると本来死ぬはずの細胞のアポトーシスが抑制されているのですか？

死にきっているところでタンパクを抽出しても評価に困るでしょうから、時系列でサンプリングしてみると良いかもしれません。

内部標準の選択 削除/引用
No.1291-5 - 2011/12/05 (月) 17:39:22 - Jin
培養細胞の種類やアポトーシスの誘導法によっては
内部標準にGAPDHを使えないことがあります。

どのような実験系を組んでおられるのかわかりませんが
GAPDHがアポトーシスの関連酵素である以上、
それを内部標準として用いることはあまりお勧めしません。

見方を変えれば、
あなたが誘導したアポトーシスはGAPDHを介した反応なのでは？
それはそれですごいことです。

(無題) 削除/引用
No.1291-4 - 2011/12/04 (日) 00:46:12 - ami
月詠さんの答えで網羅的かと思いますけど、勘的にあやしいのはここ。

> ImageJを用いてアプライ量を変化

Western blotのバンドで定量するのは、はっきりいって非常に難しいです。無理だとは言いませんが。ここを、画像をスキャナで取り込んで、バンドの強さを定量して、程度の作業でやっているなら、まったく定量できてないと思います。サンプルごとに、段階希釈して流して、同じメンブレン上で同じ強さのバンドがあるところを指標にやれば、まぁまぁいいかもしれません。それ以外の方法はあんまり信用しないです。

(無題) 削除/引用
No.1291-3 - 2011/12/03 (土) 23:30:43 - 月詠
具体的にどう揃わないのか情報がありませんので原理的な説明しかできませんけど、内部標準のGAPDHの発現量が揃わない原因として考えられるのは、主として以下の３通りです

（１）タンパク定量に失敗している
アポトーシスを誘導あるいは抑制するために加えた処理によってタンパク定量が阻害されてしまってタンパク量に誤差があるのかもしれません
SDS-PAGE後にCBB染色してアプライしたタンパク量がおおよそ揃っていることを確認すれば、この可能性は排除できます

（２）ウェスタンブロットに失敗している
トランスファーもしくはブロッティングにエラーがあってレーン毎にバラツいている場合です
ためしに同じ試料をすべてのレーンに流してウェスタンブロットしたとき、すべてのレーンで同じように検出されればこの可能性は排除できます
つまりトランスファーおよびブロッティングのステップに問題はないということです

（３）試料毎にGAPDH量が異なっている
（１）（２）のテクニカルエラーの可能性を排除できれば、残る可能性である、実験成績は正しくて、実はGAPDH量は試料毎に異なってしまっている、すなわちGAPDHは内部標準として不適切、と判断することになります
この場合は、内部標準となるタンパクを新たに検討しなければなりません
　

apoptosisのスタンダートについて 削除/引用
No.1291-1 - 2011/12/03 (土) 18:23:22 - 初めて
今年、研究室に配属された４年生です。
現在、apoptosisの抑制実験を行っており、western blottingを用いてcaspase-3の活性化を確認しているところなのですが、コントロールとしてのGAPDHが揃わなくて困っています。
サンプルは、蛋白質の定量を行ってから流し、揃わなかったらImageJを用いてアプライ量を変化させ流しているのですが全く揃いません。
原因がなにかわからなくて困っております。どなたかアドバイスをくれる方がいらしたらお願いします。
ちなみに、トランスファー装置はセミドライ式のものをもちいております。
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