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ヘテロかホモかで 削除/引用 No.1279-5 - 2011/12/04 (日) 00:55:08 - ami ヘテロかホモかではなく、そうじゃない比率の可能性はありますよね。 サブクローニングなんて、結果まで３日なので、やったほうが早いです。

(無題) 削除/引用 No.1279-4 - 2011/12/01 (木) 23:03:49 - cu 1) モザイクの可能性 モザイクの可能性を度外視して考えるとシーケンサーによるアーチファクトの可能性がありますよね 質問者の書かれている面積比は細胞内のDNAの比を反映しているわけでは必ずしもないでしょうから G/Gのときに全くAのピークが立ち上がらず、A/AのときにGのピークが全くないようなら AとGのピークが1:5になっていてもヘテロと判定できるかもしれません （もちろんモザイクの可能性は残ります） あとは 2)　PCR産物の何らかの制限酵素処理でGTGあるいはATGの一方が切断、もう一方が切断されないということが見分けられるならそれを試す 3)　mutant allele specific amplificationをしてみる くらいで少なくともAとGの比はともかくとして、AとGが両方あるかは判定できるかと思います

(無題) 削除/引用 No.1279-3 - 2011/12/01 (木) 22:38:40 - ダブルピーク > Harmonia さん 　個体（ヒトゲノム）です。

(無題) 削除/引用 No.1279-2 - 2011/12/01 (木) 21:03:30 - Harmonia 細胞？個体？部分異数体？

ヘテロ接合体シークエンスのピークの判定に関して 削除/引用 No.1279-1 - 2011/12/01 (木) 15:29:56 - ダブルピーク とあるレセプター上の多型を PCR とダイレクトシークエンスで検出しています。一方の Allele-1 では GTG（valine），もう一方の Allele-2 では ATG（methionine）という，G ⇔ A の変異が存在します。A と G のダブルピークの出現で判定していますが，サンプルによっては，A と G のピークの比（目算による大まかな面積比）が，1:1 とならずに 1:5 くらいのものがあります。これをヘテロと判定するか，ホモと判定するかで悩んでいます。逆方向から読んだ場合も同じ結果となっています。つまり，forward で，「A が 5，G が 1」の面積比のものは，reverse では「T が 5，C が 1」という面積比です。自分では，おそらくこのサンプルはヘテロ接合体で，最初の PCR の際に GTG を持つ Allele-1 が，何らかの理由で PCR がかかり難く，シークエンス反応の鋳型量に差があった為と考えています。プライマーを設定した位置には多型は（これまでのところ）見つかっていないのでプライマーのミスマッチとは考えられないのですが……。みなさんはこういった際，どのように判定なさいますか。PCR 後にサブクローニングするのが最も良いと思いますが，急いでいてその時間が無いのです。何かアドバイスありましたらよろしくお願い致します。

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