全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1276-12 - 2011/12/03 (土) 05:34:38 - ab > 反応時間に関しては、プロトコルの最短の時間１５分を採用しております。 > まだ短くても良いのでしょうか。 量に依存しますが、強ければ最短1.5~2分でも蛍光が見えるはずです。 比色法と違ってパッと見でわからないので、あればUVランプで確認することをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.1276-11 - 2011/12/02 (金) 09:35:13 - 初心者 mAbさん 水道はアスピレーターとして使用していて、 洗浄は付属のBufferで行っています。 当方もTECANのプレートリーダーを使用しております。 optimalを選択すると自動でGainを設定してくれる、ということですね。 希釈して〜というのはまだ行ってていなかったので、検証してみます。 ~さん 仰るとおり、吸い口は１つだけです。 チップを交換せず、濃度の低いものから順に吸っています。 クロスコンタミの可能性は否定できません。 やはりその可能性は高いですよね。 全工程で1つのチップを使っているので、 洗浄1回ごとにチップを交換する、などで少しは改善されるでしょうか。 teさん 投稿ありがとうございます。 マニュアルに関しては、再度熟読します。 欲しい情報が記載されておらず、内容がいまいち理解しづらいことがあるので もっと英語も勉強しなくてはならないようです。 abさん 投稿ありがとうございます。 BlankにはHRPと基質だけを入れています。 なので、基質のみでの測定を行ってみます。 反応時間に関しては、プロトコルの最短の時間１５分を採用しております。 まだ短くても良いのでしょうか。 皆様からのご指摘、ほとんどが洗浄に関する問題ですね。 担当の先生と相談の上、問題点をつぶしていこうと思います。 実験を進めていく上でわからないことなどが出てきましたら 引き続き状況を書き込みたいと思っておりますので もしよろしければ、またアドバイスをいただけたら、と思います。 勉強になりました。本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1276-10 - 2011/12/02 (金) 07:42:32 - ab blankが異常に高い（サンプルより高い）ので、洗浄不足かクロスコンタミネーション、あるいは反応時間が長過ぎる疑いがあります。 一応確認ですが、blank wellには、primary antibodyもbiotinylated peptideも入れずに、HRP-avidinだけ入れてますよね？ HRP-avidinも入れずに基質だけで測定してみると、基質がおかしいかどうか確認できます。 すでに指摘されているように、洗浄の問題の可能性が高いと思います。 アスピレーターは使わない方がよいです。 そのまま、プレートを逆さまにして流しに捨ててもいいし、ペーパータオルに吸わせてもよいです。 自分でやるときは、結構勢いよく振って、流しに捨ててます（バッファーだけなら）。 壁面に液が残ると擬陽性の原因になるので、しっかり除去します。 洗浄方法の問題でなければ、他のwellの値もかなり高めなので、反応時間を短くしてもいいと思います。 長波長のハンディ型UVランプがあれば、反応停止前に反応の具合を確認できます。 反応が進んでいれば、青く見えるはずです。 ちょうどよい反応時間は条件で変わってくるので、自分のラボで最適の反応時間をみつけて測定するとよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1276-9 - 2011/12/02 (金) 00:42:02 - te 企業のテクニカルに問い合わせるのは良いアイデアだと思います。 またマニュアルを読み直すのもいいかもしれません。 例えば、Manual washing may cause high duplicate coefficient variations. To reduce this factor, liquid from the plate should be removed by inverting and blotting the plate on an absorbent material.とかって書いてあると思うのです。

(無題) 削除/引用 No.1276-8 - 2011/12/01 (木) 20:19:57 - mAb 勘違いして投稿してしまいました。 洗浄バッファーは付属バッファーで、アスピレーターとして水道を利用しているのですね。 稚拙な文章ですいませんでした。 問題の件、protocolに標準品の測定値が乗っていると参考に出来るのですが、Blankが20000を越えているのは高いと思います。 蛍光で重要なのはGainの設定です。 当方が使用しているTECANリーダーは、optimalモードで最適なS/N比を出すgainを自動で設定してくれます。 検証としては、HRP標識抗体の希釈系列を作り、基質溶液に加えて添加量依存的なシグナルが出るか試されてはいかがですか。

(無題) 削除/引用 No.1276-7 - 2011/12/01 (木) 20:17:02 - ~ 水道水の水流で陰圧を作り、アスピレーターとして使っているだけですよね？ 心配なのは、おそらくアスピレーターの吸い口は1個だけですよね。1ウェルずつチップを変えるのは困難でしょうから、クロスコンタミが起きていないかどうかという点ですが。 また、1個ずつ変えているとしたら、時間がかかりすぎて乾燥していませんかね。

(無題) 削除/引用 No.1276-6 - 2011/12/01 (木) 20:07:08 - mAb 市販キットなのに水道水で洗浄とは何事かと思い、protocolをざっと読みました。 付属バッファーで洗浄すると書いてありますよ。 protocolを良く読みこなし、作業を進めてください。

(無題) 削除/引用 No.1276-5 - 2011/12/01 (木) 15:55:23 - 初心者 mAbさん、~さん コメントありがとうございます。 やはり手技的な問題はあるかと思っておりますので、 直接企業のテクニカルに問い合わせてみようと考えています。 洗浄に関しては、手動で行っております。 水道にチューブでパスツールを繋いで、先端に黄色チップを付けて、アスピレーターとして使用しております。 補足ですが、結果を記載しておきます。 Blank　　 →28269/21379 TB　　 　 →16887/27231 1pg/ml　 →16559/15654 10pg/ml　 →15886/17678 100pg/ml →13461/16938 1000pg/ml →21901/22590 10000pg/ml→14373/43424 PC　　　　→24274/43193 プレートリーダーの設定は以下の通りです。 Mode：Fluorescence Top Reading Excitation Wavelength：325nm Emission Wavelength：420nm Excitation Bandwidth：9nm Emission Bandwidth：20nm Gain：106Optimal Number of Reads：25 Integration Time：20µs Lag Time：0µs Settle Time：0ms よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1276-3 - 2011/12/01 (木) 10:26:45 - ~ 測定値はばらばらなのでしょうか？ それとも、全部高かったり、全部低かったりしているのでしょうか？ また、キットの付属のプレートなので無いとは思いますが、他のウェルからの漏れ込みがあると仮定すると測定値に説明がついたりしませんか？ 比色で出来ているのであればそこまで手技に問題があるとは考えにくいのですが、プレートリーダー側の設定やフィルターは大丈夫でしょうか。 後者については、ELISAで異なるプレートリーダーで測定した数値を比較すること自体避けたほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1276-2 - 2011/11/30 (水) 17:25:27 - mAb キャリブレーターが立たない可能性を思いつくままに、 １）キット性能（標準品の劣化） ２）手技の問題 ３）洗浄不足 １）他者の使用実績（論文等）、キットの使用期限は問題ないですか？ ２）キャリブレーターが立たないのならば系自体の問題です。 直接企業のテクニカルに聞くか、もしくば納入業者に問題を伝えて代替品の入手も考えてはいかがですか。 ３）発色法に比べて洗浄はシビアに行うべきです。 ウォッシャーを使用していれば機器に不備はないか、 手洗浄ならば残液を完全に捨てる等、かなり注意して洗浄を行うべきです（手洗浄は余りお勧めできません）。

ELISA 蛍光法 削除/引用 No.1276-1 - 2011/11/30 (水) 15:18:49 - 初心者 ELISA初心者です。 現在PHOENIX PHARMACEUTICALS,INC.のFEKキットを用いてヒトSerum中のGLP-2濃度を測定しようとしています。 ですが、何回やっても検量線がうまく引けません。 今までにELISA比色法は行ったことがあるのですが、蛍光法は初めてで、 キットのプロトコル通りに実験を行っても、スタンダードで濃度依存的な値が出ません。 何が原因なのか、まったく見当が付かず、 思い当たることをいろいろ試してみているのですが 未だ成功しておりません。 ELISAの蛍光法を行う際に気をつけるべきことなど、 初歩的なことで申し訳ないのですが教えていただけないでしょうか。 また、これは比色法でも同じなのですが、 Excelにて検量線を引く際に、 専用のソフトウェアと同じ値になりません。 計算式など調べて入力してみているのですが、 違うプレートリーダーを使用した場合に式が出せないので 比較ができません。 こちらも併せてアドバイスいただけるとありがたいです。 よろしくお願いいたします。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---