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(無題) 削除/引用 No.1275-22 - 2011/12/07 (水) 01:29:58 - てすと Wolfgang Ostwald stated, “There are no sharp differences between mechanical suspensions, colloidal solutions, and molecular [true] solutions. There is a gradual and continuous transition from the first through the second to the third.” 「溶ける」って定義するの難しそうですね。 ところで、濁度って化学物質が溶けることの一つの判断基準にはならないんですか？「濁度を利用した溶解度測定」とかって検索にはたくさんかかってきますけど。完全に透明な沈殿用物質があったりしたら、濁度が測定できないからダメか？？

(無題) 削除/引用 No.1275-21 - 2011/12/05 (月) 23:57:30 - ji 皆様、コメント有難うございました。 皆様のご指摘通りどのプロトコールを見ても、遠心は必須のようでした。 コメントを読み返してもまだ理解できない部分も多々あるのですが、 来週から実際に手を動かします。その中で、皆様の言っている内容が 少しでも理解できればと、思っています。

(無題) 削除/引用 No.1275-20 - 2011/12/05 (月) 22:03:44 - 案ずるより生むが安し 私の意図は、すでに指摘されていますように、最初の質問にある、免疫沈降の初心者がマウスなどの細胞を可溶化する際の現実的な面を前提にしています。それでもいろいろ拡大解釈は可能ですが、可溶化は何か？はそれぞれご自分で定義や前提を明らかにすれば、議論する以前の話になると思います。 ちなみに、現実的に、遠心15,000　rpmを10分かけた上清を使う場合。きちんとネガティブコントロールの抗体も使い、免疫沈降をProteinAセファロースで、瞬時遠心で何回か洗うというスタンダードな操作をしたなら、とくに問題は起きないでしょう。例外的にネガティブコントロールに問題が起きたなら、そのときによく考えるということです。

(無題) 削除/引用 No.1275-19 - 2011/12/05 (月) 15:35:30 - き http://www.youtube.com/watch?v=BGopZLMcVJA

(無題) 削除/引用 No.1275-18 - 2011/12/05 (月) 14:43:43 - か タンパク質の可溶化液というのは一種の親水コロイドの様な分散系ではないでしょうか？ 物質が溶解すると定義される粒子径よりも大きいように思われます。 なので見た目に溶解したように見えたとしても、ある程度の遠心で粒子径の大きな不溶性物質は沈降するのでは？ 専門外なので間違っているかもしれませんが。

可溶化 削除/引用 No.1275-17 - 2011/12/05 (月) 11:56:57 - お粗末君 このスレッドは可溶化の判断基準を問うているのでは？ 濁度は可溶化の判断基準にはなりません。 細胞を溶解して濁るかは問題ではありません。 また、通常IPで使われるバッファー中で15,000xgを10分かけて沈んでこないものが 可溶化しているとは限りません(多くの方はこれでIPしていますが)。

(無題) 削除/引用 No.1275-16 - 2011/12/04 (日) 20:14:37 - エメマン タンパク質溶液が濁ると言っているのではなく 細胞溶解の段階で濁ると言っているのでは？

空想 削除/引用 No.1275-14 - 2011/12/02 (金) 10:24:05 - お粗末君 タンパク質溶液が濁るという根拠は？ 血清のタンパク量はとてつもなく高いですがどうですか？ 濁っていませんよね。（大腸菌を計る際の濁度と、タンパク定量の際のUV吸収は異なります。UV法を根拠とするのは不適切です。） 推測は実験のスタートラインであって、科学的根拠としては無意味に等しいので いいかげんな事は言わないように。

(無題) 削除/引用 No.1275-13 - 2011/12/02 (金) 10:11:01 - 案ずるより生むが安し 案ずるより生むが安し、でやってみれば一発でわかるのですが、普通はIPは核膜が溶けないマイルドなデタージェントを使うので、かなり溶液はくもっています。よって透明で特に沈殿物が見えない状態とは決してなりません。

(無題) 削除/引用 No.1275-12 - 2011/12/02 (金) 02:11:02 - とけ 良く知りませんが、「溶ける」と言うと溶媒の中にうまく混じっているイメージなので、溶媒と同じような挙動をするかどうかが基準になりませんかねぇ？化学の分野で溶解度の測定とかはどうやっているんでしょうか？中学のときくらいだと、見た目で透明かどうかが判断基準だった気もしますね。 あと、細胞をタンパク溶解剤に溶解した際には、濃度にもよると思いますが、多くの場合、濁ってみえるんじゃないでしょうか。

可溶化 削除/引用 No.1275-11 - 2011/12/01 (木) 14:17:23 - ema jiさまがやる実験から、遠心は私は必須だと。 なんとなく説明の”薬剤関係”という言葉、jiさんの言う溶けているの概念は試薬が溶けているの概念のみのようなので混乱しているのでは？ 試薬で構成が判っている純粋な物ならそうですね。 ”細胞”の中には純粋な物質でない多種なものが含まれ、jiさまは蛋白をみたいのですが、それ以外の核酸、培養細胞で（まあ培養でもありますが）組織ですと脂質その他の色々な物質が一緒にあります。蛋白も可溶、不溶のものがあり膜のように非常に大きな状態で残るものがあるのです。 もし化学の方の物性には明るいのでしたら不純な物からの純粋な物質の回収には遠心したり、分画したりということが必要であるとお判りになるのではないでしょうか。 ”免疫沈降”をするなら他の方も色々お書きになっている様に基本に（理由があってプロトコールは作製される物です）忠実に遠心をした可溶上清を使用してください。

可溶化 削除/引用 No.1275-10 - 2011/12/01 (木) 12:13:32 - o 可溶ってどうやって定義するんでしたっけ？昔聞いた事があるような気がするのですが思い出せません。００ｘｇの遠心の上清画分を可溶化画分と呼ぶとかってするんですっけ？ 磁気ビーズって話もありましたが、ビーズが通らないくらいのザルにかけて（カラム式に洗浄する）やれば他のビーズでも遠心しなくてもいけそうですね。 ネガコンを上手くとれば何とかなる？ならない？？

(無題) 削除/引用 No.1275-9 - 2011/12/01 (木) 11:41:52 - ji たくさんのご指摘感謝致します。 しかし、少々頭の中が混乱して理解できていません。 私はタンパク質を殆ど扱ったことがなく、薬剤関係の者なのですが、 薬剤をある溶媒に溶解して透明であれば遠心しなくても溶解している と思っていました。

(無題) 削除/引用 No.1275-8 - 2011/12/01 (木) 09:28:39 - う ＞では、遠心しなくてもいいんじゃないですか。 老婆心ながら、 上記のように書いたのは、シャレって伝わっていますよね？ 磁気ビーズなら、チューブの底に沈殿してこないからとかいう 実りの無いことを言い出すと、論議が逸れるので。 磁気ビーズを使った実験は、免疫「沈降」とは言わないとか言ったりしてね。 他の方も指摘されていますが、 ごっちゃになった塊がチューブの底に溜まるのと 磁気ビーズにごっちゃになった塊ごと集めるは ほとんど同じことですから。 極端な話、溶け残った細胞を 細胞表面抗原で免疫沈降して細胞ごと集めたとき そこから検出タンパク質は全部インターラクションしていることになるわけで。

(無題) 削除/引用 No.1275-7 - 2011/12/01 (木) 08:50:57 - おるがねら ここにいる皆さんは御存知かも知れませんし話がずれますが 細胞内オルガネラをクルードなサンプルから免疫沈降する手法があります。 いわゆる、〜マーカーの様なタンパク質に対する抗体を使って。 しかし、クルードと言っても簡単な遠心なり、濃度勾配である程度あたりを絞ってからですが。

可溶化 削除/引用 No.1275-6 - 2011/11/30 (水) 18:39:29 - お粗末君 細胞骨格系等を巻き込んでると間接的な分子がいくらでも共沈します。 インパクトファクターが高めでも免疫沈降してウェスタンだけしか出していない論文を見かけますが、当てになりません（磁気ビーズを使用してる場合も含む）。 そのような分子を釣ってきても先が無いですよ。 意図的にそのような方法も使う場合はありますが、リスクを把握した上で行ってください。 また、免疫共沈降だけで得られた候補がインタラクションしていると本気で思っている人はいません。

(無題) 削除/引用 No.1275-5 - 2011/11/30 (水) 16:19:18 - う そうですね、磁気ビーズを使うというのがありましたね。 では、遠心しなくてもいいんじゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.1275-4 - 2011/11/30 (水) 15:30:27 - シリウス ＞だから、免疫沈降の前に細胞抽出液を遠心して「少なくともその時点で沈降してくるもの」を除かないと免疫沈降で沈降してきたタンパク質との区別がつきません。 磁気ビーズを使う場合、このような議論は成り立たなくなりますが・・・ 本題に戻りますが、見た目が均一そうに見えても、実際、遠心すると、沈殿物が出てきます。 可溶化タンパク質というならば、やはり、遠心は必要だと思います。 お役にたてば、幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1275-3 - 2011/11/30 (水) 14:56:51 - う 可溶化という言葉をどこまで追求するのか？ そんな質問にに思えますが、その前に技術的な指摘を。 免疫「沈降」なのです。 そもそもこの実験はその過程で遠心して目的タンパク質を 「沈降」させます。 だから、免疫沈降の前に細胞抽出液を遠心して 「少なくともその時点で沈降してくるもの」を除かないと 免疫沈降で沈降してきたタンパク質との区別がつきません。 それくらいは想像して下さい。 ＞この際、遠心しないで行うことはしないのでしょうか。 自ずと答えは出ると思います。 ＞例えば、細胞をタンパク溶解剤に溶解した際に、透明で特に沈殿物が見えない場合、その細胞は可溶化していると言えるのでしょうか。それとも、遠心しても沈殿しないものを可溶化しているというのでしょうか。 例えば、塩化セシウム溶液を超遠心すると、濃度勾配ができます。 このとき、塩化セシウムは可溶化していると言うのでしょうか？言わないのでしょうか？ これと同じようなことを質問しているように思えます。 それに何の意味があるのでしょうか？ 私には何を念頭においての質問かわかり兼ねます。 乱文失礼。

(無題) 削除/引用 No.1275-2 - 2011/11/30 (水) 14:54:36 - 月詠 免疫沈降の原理とプロトコールをお考えになれば解ることだと思います 細胞溶解液に抗体を加えて、その後どうされますか？ 通常、抗体はあらかじめ担体上に固定されているか、 あるいは抗原抗体反応後に担体を加えて抗体を吸着させて、 担体に吸着した抗原抗体複合体を遠心分離で沈降させて、 抗体に結合しなかった他の細胞成分から分離するのですよね でも、このとき、この遠心条件で、目視では確認できないけれど 担体に混じって沈降してくる微粒子（たいていは不溶細胞膜画分） があったらどうなりますか？ 抗体に結合しない（対象抗原ではない）膜タンパク質も 一緒に沈降してくることになりませんか？ 原理的には、その後のSDS-PAGE解析等で検出されるバンドは、 目的とする抗原タンパク（＋非特異的結合されたタンパク）と、 抗体（軽鎖＋重鎖）と担体に付属しているタンパク質（たとえば protein A等）のみのはずですけど、あなたの方法だと 抗原抗体複合体とはまったく関係なく沈殿してくる不溶粒子に由来する タンパク質まで検出されてしまうことになってしまいませんか？ したがって、細胞溶解液を、抗原抗体複合体を回収するときの条件より 厳しい条件で遠心分離して不溶性残渣を確実に除去し、抗原抗体複合体 の分画にそれ以外の粒子が混じりこまないように留意しておかなければ、 この手法はそもそも成立しえない、ということです

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