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(無題) 削除/引用 No.127-13 - 2011/03/11 (金) 06:16:41 - ポスドク ご意見をありがとうございます． 精製タンパクがちょっと古かったかな，というのが実は気になっていたので，精製しなおし， プローブ量を濃いのに戻し，条件もいじってみたところ， 500ngで濃いシフトを確認することができました．薄くしても大丈夫そうです． コントロールについてもこれから検討予定です． ご意見非常に参考になりました． ありがとうございました．

(無題) 削除/引用 No.127-12 - 2011/03/09 (水) 14:51:29 - Boston-Pullman 私が扱っている転写因子はリン酸化で転写活性が上がります。 トピ主さんのタンパク質のDNA結合能がリン酸化で強くなるかもしれません(ネガティブチャ-ジ同士なので考えにくいですが)。 当然、大腸菌で発現させたものは未修飾です。 こうした可能性がある以上、理想の条件で結果を出す努力を数ヶ月仮に費やすとしたら、それは時間の無駄だと思います。 抗体がないとの事ですが、手に入らないと言う意味でしょうか？ もしそうであれば、FLAG-tag のタンパク質を発現させてChIPを行うなり(プロ-ブに使っている数百bpのPCR産物でも良いので)、核抽出液を用いて、super shift アッセイするなり、他に手段はあるはずです。 どうしても条件検討をしたいから知恵を貸してほしいと文章から感じますが、指導教官に相談した方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.127-11 - 2011/03/09 (水) 07:13:58 - おお >DNA量は当初200fmolでやっていたのですが，シグナルがとても強かったので減らしました． 無茶苦茶シグナルが出るほどのプローブを載せるのがたいていのプロトコールです。最近のきっとの標準プロトコールは20fmolになってますね。長さによりますけどngのオーダーです。RIではpgオーダーは余裕で検出できますので実際にRIのシグナルはサザンとかやっているのに比べると怖くなるほどのシグナルがでます。 あとこの手のアッセイは結合している状態でえいどうされる訳ですが、えいどう中のリリースも考えるとみかけのkdより落ちるのではないかとか、そういう議論もあるにはあります。なのでプローブ過剰はタンパク過剰よりアクセプタブルなのではと思います。 １度標準のプロトコールに照らし合わして見るのもいいのではと思いました。

(無題) 削除/引用 No.127-10 - 2011/03/08 (火) 18:31:50 - コント 最初の雰囲気からは、いいのじゃないかという感じがしましたが、結合領域のみの変異のあるDNAを使ったコントロールをとっていないということ、おそらく10 uM (microM)のオーダーでしかシフトが起こらないということから、かなり心配なデータです。

(無題) 削除/引用 No.127-9 - 2011/03/08 (火) 16:52:22 - Boston-Pullman 結合領域以外に結合してしまう事を非特異的結合というので、結合領域以外の配列が長ければ非特異的結合のリスクは高くなります。

ありがとうございます 削除/引用 No.127-8 - 2011/03/08 (火) 13:27:05 - ポスドク 皆様，貴重なご意見をありがとうございます． 抗体がまだ今はないのでChIPがまだできないのですが，他の実験も含めて今後検討する予定です． シフトがあるとき，フリープローブのバンドは明らかに減っており，タンパクを加えない時に比べて若干上にシフトしていますが，それよりずっと上に濃いシフトバンドがあります． そんなに多くの条件試していないので，タンパク量をせめて1microMにできるように，もうちょっと条件をいじってみようと思います． 詳細な標的部位が不明なので，今後絞りこんでいっているのですが，タンパク量が過剰なための非特異的なシフトだった場合，DNAの長さが長い方がその現象が起こりやすいと考えられるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.127-7 - 2011/03/08 (火) 11:20:07 - おお タンパク量に依存して結合力が強くなる場合は、アロステリックな変化があるかもしれません。低い量で検出できないのは検出限界以下になったためドラスティックに変わった印象が出てるかもしれません。 ライセートを使った場合はプローブのほうが見かけ過剰になりフリープローブが可也見られることが多いです。逆にリコンビナントを使った時はタンパクのほうが過剰になる傾向があります。この時はフリープローブが減っているのが容易に観察できるぐらいになると思いますが、ug単位のタンパクを乗せるとちょっと多すぎるかなァという感じはあります。タンパクはナノグラムのオーダーで使っているプロトコールが多いと思います。ライセートもとり方によりますが多くて目的のタンパクは1ng/laneかそれよりももっと少ない可能性もあると思います。核抽出液を使うと物によってはもっと多いかもしれません。 いずれの場合もネガティブコントロールを取ることが重要だと思います。そういう意味では皆さんと一緒です。結合する条件、コントロールがすでに思うように行っているわけですから(多分)あまりいじるよりは、Chipアッセイや転写関係だったらルシフェラーゼアッセイ。ライセートでのEMSA、ノックダウンによる転写活性の低下(抑制因子であれば上昇)そのた目的に合わせたデーターを取るのがいいかと思います(生物学的なファンクションなどを考えているのなら)。

(無題) 削除/引用 No.127-6 - 2011/03/08 (火) 09:28:08 - コント 私も同意見です。 ＞このようにタンパク量がDNA量に対して過剰の場合にはバンドがシフトしてしまうものなのでしょうか？ ＞シフトが見られないものもあるので，配列特異的ではあると思うのですが，親和性が低いということなのでしょうか？ 過剰の場合にはバンドがシフトするとおもいます。配列特異的ならば、そこだけを変異させたもので同じ長さでくっつかないというコントロールが必須です。 そのコントロールがきれいに取れれば、親和性が低いのは個人的には許してもらえると思います。 ＞タンパク量を減らしてもシフトが見られるような条件を見つけられる余地はあるのでしょうか？ ありますけど、ある程度条件を試したのなら、時間の無駄になるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.127-5 - 2011/03/08 (火) 06:54:00 - Boston-Pullman たしかに、同一プロモーター、エンハンサー上に結合部位が複数存在することも考えられますね。 分子数は見当がつきませんが、免染して核全体が染まるのであれば、かなりの数存在するのではないでしょうか。 ゲルシフトは完全な in vitro 系なので、ChIP assay のデータは要求されるかと思います。結合するしないは生理的条件のChIPの役目で、ChIPで解析できないことをやるのがゲルシフトの役目だと思っています。 繰り返しになりますが、コントロールさえ取れていれば、ゲルシフトの実験としては良い気がします。

(無題) 削除/引用 No.127-4 - 2011/03/08 (火) 05:32:40 - おお >[Re:3] Boston-Pullmanさんは書きました : > 細胞内には２コピーの染色体（X,Yを除く）があって、それを上回る分子数のタンパク質が存在します。点変異プローブ、変異タンパク質を用いたコントロール実験がちゃんとしていれば、問題ないと思います。 横から失礼します。転写因子を考えるならターゲットの遺伝子は一つと限らないですし、上流に複数の結合部位がある場合がありますよね。細胞内に何分子あるという解析例が有りますでしょうか。ウエスタンで検出できると考えると1000分子ぐらいはありますかね。。。

(無題) 削除/引用 No.127-3 - 2011/03/08 (火) 04:59:23 - Boston-Pullman > このようにタンパク量がDNA量に対して過剰の場合にはバンドがシフトしてしまうものなのでしょうか？ 細胞内には２コピーの染色体（X,Yを除く）があって、それを上回る分子数のタンパク質が存在します。点変異プローブ、変異タンパク質を用いたコントロール実験がちゃんとしていれば、問題ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.127-2 - 2011/03/08 (火) 04:50:24 - おお >[Re:1] ポスドクさんは書きました : > 上記の濃度でタンパク量を10micro molではシフトが見られますが，1micro molではほとんど見られません． このたんぱく質量は濃度(uM)ですか?濃度でなければ相当な量になりますよ1micro molでも。 例えばトータルライセートなどを使った条件ではたんぱく質よりDNAの方が大過剰になりがちだと思います。0.1-100ngのたんぱく質で200fmol位のDNAを加えるのがいいのではないでしょうか。 勿論リコンピナントの得られたたんぱく質の100%が従来の構造を取っているとは限りませんので、そういう意味ではほかの実験根拠も加味したうえで500ng位までは何とかアクセプタブルかもしれません。

ゲルシフトについて 削除/引用 No.127-1 - 2011/03/08 (火) 04:22:34 - ポスドク ビオチン化プローブを用いてあるタンパクのDNA結合性をゲルシフトでみています． タンパクはHisタグ付きで発現させたものをNiカラムで精製したものを用いています． プローブの長さは100bpから300bpのものをいくつか用いています． その中で強いゲルシフトが見られるものがあり，競合的DNA（ラベル化していないDNA）を入れた場合にはシフトがなくなりました． しかし，私の用いているプローブ量（約2fmol）は類似の実験の論文（20-200fmol）と比べると少なく， 上記の濃度でタンパク量を10micro molではシフトが見られますが，1micro molではほとんど見られません． DNA量は当初200fmolでやっていたのですが，シグナルがとても強かったので減らしました． このようにタンパク量がDNA量に対して過剰の場合にはバンドがシフトしてしまうものなのでしょうか？ シフトが見られないものもあるので，配列特異的ではあると思うのですが，親和性が低いということなのでしょうか？ タンパク量を減らしてもシフトが見られるような条件を見つけられる余地はあるのでしょうか？ ご意見をよろしくお願いします．

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