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(無題) 削除/引用 No.1265-4 - 2011/12/05 (月) 15:57:52 - 15 qq様、〜様 この度はアドバイスをくださり、誠にありがとうございました。 qq様には早急にアドバイスをいただき、ありがとうございました。 自分自身で条件検討する必要があると感じ、早速コロニーピックアップの練習を致しました。 なお、トリプシンを作用させる際には、ディッシュを一度PBSで洗浄しております。 24ウェルに播種したコロニーは、順調にスケールアップできております。 Stableに発現させたプラスミドが機能するかどうかが不安ですが。。。 この度は誠にありがとうございました。 15

(無題) 削除/引用 No.1265-3 - 2011/11/30 (水) 11:27:49 - ~ >ワセリンを底に塗ったクローニングキャップを目的コロニー上に置き、 これの前にはディッシュをPBSで洗っていますよね？ 洗っていないと残った培地中のFBSでトリプシンが全く効かない場合もあります。 qq さんの書かれている予備検討を行なうのであれば、撒く細胞数を変更しておいた方が(例えば30, 100, 300cell/5cm-dish)、Plating efficiencyの確認も同時に出来てよりよい実験条件の検討になると思います。 また、5cm dishではクローンリングをあまり入れられず練習しにくい上に、本番でもdish1枚から数個しか取れません。私ならば検討、本番共に10 cm dishでやります。 さらに、セレクションしたディッシュでそのままクローニングするのであれば、導入効率とplating efficiencyの両方を考慮して撒き数を決める必要があります。 私がHeLa細胞でリン酸カルシウム法で入れていたときは、1万〜10万 cells/10 cm dish位で撒いていました。 導入効率がいいときは1万 cells/dish、悪い時は10万 cells/dishのdishで数十個のコロニーが出来、他のコロニーと離れているところから10個くらい取っていました。 （欲しいクローン数に合わせて、撒くdish数は加減していました）

(無題) 削除/引用 No.1265-2 - 2011/11/29 (火) 23:00:37 - qq 親細胞を100cell/5cm-dish程度に数枚まいて、普通の培地で10日くらい培養すると、500-1000細胞のコロニーができますから、それを使って、試してみるとよろしいです。 トリプシンをいくら入れようかとか、濃度をいくらにしようかとか、どの程度ピペッティングしようかとか、いろいろ試したところで、クローンを拾うのが安心ですよね。

Stable cell line 作成にあたりクローニングキャップの使い方 削除/引用 No.1265-1 - 2011/11/29 (火) 19:49:56 - 15 付着細胞（RAW264.7細胞）のstable cell line を作製するにあたり、選択マーカーで生き残った細胞（コロニーを形成している細胞）をクローニングキャップを使用して、回収したいと考えております。 方法としては、ワセリンを底に塗ったクローニングキャップを目的コロニー上に置き、トリプシンを流し込んだ後、ピペッティングを行い剥離・回収、選択マーカー含有の24ウェルプレートで培養する予定でおります。 その際、クローニングキャップ中でピペッティングすることでコロニーを十分に剥離・回収できるでしょうか。 また、回収した細胞を24ウェルプレートで培養する際、トリプシン（約5 %）が含有されていても大丈夫なのでしょうか。 御教授いただけましたら、幸いです。よろしくお願い致します。

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