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WBサンプル調整法(論文より) トピック削除
No.126-TOPIC - 2011/03/08 (火) 01:10:50 - ぽすどく
 論文のMethodに以下のような記述を見つけました。同じ方法を試したいのですが、よくわからない点があります。最後に1%SDSに溶解してタンパク定量とあるのですが、この1%SDSとは単にSDSを水に溶かしたものなのでしょうか。WBにあまり詳しくないので、詳しい方に教えていただければ幸いです。


 After treatment, IF-enriched cytoskeletal fractions were obtained
from striatum. Briefly, after the labeling reaction, slices were
homogenized in 400 ml of ice-cold high-salt buffer containing 5 mM
KH2PO4 (pH 7.1), 600 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 1 mM
EDTA, 1% Triton X-100 and the protease inhibitors described above.
The homogenate was centrifuged at 15.800×g for 10 min at 4 °C in an
Eppendorf centrifuge, the supernatant discarded and the pellet
homogenized with the same volume of the high-salt medium. The
resuspended homogenate was centrifuged as described and the
supernatant was discarded. The Triton-insoluble IF-enriched pellet,
containing the IFs was dissolved in 1% SDS and protein concentration
was determined.
 
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KClも注意 削除/引用
No.126-5 - 2011/03/08 (火) 09:36:43 - ats
しっかり上清を取り除かないとK-SDSの沈殿(不溶)も出そうですね。

(無題) 削除/引用
No.126-4 - 2011/03/08 (火) 05:36:22 - おお
水にとかしたSDSなら特に低温で析出してくる事があります。そのへんを注意しないといけないかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.126-3 - 2011/03/08 (火) 05:06:59 - ぽすどく
 ありがとうございます。そのようにしてみます。

(無題) 削除/引用
No.126-2 - 2011/03/08 (火) 04:26:12 - おお
この記述を見る限り水で溶かした1%SDSという感じがしますね。
そのごタンパク量をはかり、タンパク濃度を1%SDSでそろえてから
2xサンプルバッファー(物によってはもう少し濃いものもある)を加えてボイルしてSDSPAGEに持っていくという手順じゃないでしょうか。

WBサンプル調整法(論文より) 削除/引用
No.126-1 - 2011/03/08 (火) 01:10:50 - ぽすどく
 論文のMethodに以下のような記述を見つけました。同じ方法を試したいのですが、よくわからない点があります。最後に1%SDSに溶解してタンパク定量とあるのですが、この1%SDSとは単にSDSを水に溶かしたものなのでしょうか。WBにあまり詳しくないので、詳しい方に教えていただければ幸いです。


 After treatment, IF-enriched cytoskeletal fractions were obtained
from striatum. Briefly, after the labeling reaction, slices were
homogenized in 400 ml of ice-cold high-salt buffer containing 5 mM
KH2PO4 (pH 7.1), 600 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 1 mM
EDTA, 1% Triton X-100 and the protease inhibitors described above.
The homogenate was centrifuged at 15.800×g for 10 min at 4 °C in an
Eppendorf centrifuge, the supernatant discarded and the pellet
homogenized with the same volume of the high-salt medium. The
resuspended homogenate was centrifuged as described and the
supernatant was discarded. The Triton-insoluble IF-enriched pellet,
containing the IFs was dissolved in 1% SDS and protein concentration
was determined.

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