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(無題) 削除/引用 No.1258-7 - 2011/12/10 (土) 01:09:10 - KEN nanodropの測定データと必ずしも分解されていないRNA量はマッチしません。 以前、nanodropの濃度は高いのに、結果が今ひとつだったことがあり、それ以来、少し分解が疑われる怪しげなサンプルを用いる場合は少し、値段はかかりますが、バイオアナライザを用いています。 解剖から凍結もしくはRNlaterにつけるまでに少し時間を食ってしまったとかいう場合は、使われてみることをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.1258-6 - 2011/11/28 (月) 11:30:39 - 学生 ＞xyz様 ご返答ありがとうございます。 やはり低発現が原因でPCRでの結果がブレるということはあるのですね。 PCR反応は45cycleまで回しておりまして目的遺伝子の発現量があまり高くないというのは間違いないと考えております。 PCR条件の見直しについて、検討してみたいと思います。 ありがとうございます。 ＞月詠様 ご返答ありがとうございます。 RNA量の補正はnanodropで測定した濃度をもとに逆転写前に行っております。計算上等量のtotalRNAを逆転写し、同じ希釈率で薄めたcDNA溶液をtemplateとしてPCR反応を行っております。 インナーコントロールであるβ-actinのPCR反応についてなのですが、バンドの濃さから判断して飽和には達していないと考えております。また定量はしていないのですが同じくバンドの濃さから判断するにサンプル間での供給cDNA量に大きな差はないと思われます。 「（その臓器では）個体毎に目的遺伝子の発現が異なっている」 という解釈についてなのですが、もちろん可能性としてなくはないと思うのですが、 １．発現量があまり高くないと思われる複数の臓器で同じ現象が見られる ２．目的遺伝子の特性として粘膜上皮に恒常的に発現していると予想される 等のことからその可能性は低いと考えております。 追加で気になったことがあるのですが、 totalRNAを抽出する前の段階での臓器の凍結保存はどの程度の期間であれば大丈夫なのでしょうか？ マウスより摘出した臓器はそのまま液体窒素で瞬間凍結し、試薬を使ってtotalRNAを抽出するまでのしばらくの期間-80℃で保存しているのですが、考えてみると-80℃での臓器のままの保存は１週間から長いものだと１カ月に達しているように思われます。 先日、研究室の者に「肺などからRNAを取ってくる際は時間との勝負でRNAはあっという間に壊れてしまうので注意が必要」という話を窺ったのですが、今回の私の件についても（臓器は肺ではないのですが）１週間以上に及ぶ臓器のままでの-80℃での凍結保存が原因であるということは考えられるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1258-5 - 2011/11/26 (土) 19:34:07 - 月詠 鋳型として供するＲＮＡ量の補正はどの段階でされているのでしょうか？ インターナルコントロールのβアクチンのＰＣＲ産物が飽和に達していない サイクル数でバンドの濃さが同じ（＝鋳型として供したＲＮＡ量は等しい） という”前提”であるのであれば、 個体毎に目的遺伝子のバンドが検出したりされなかったりするのは、 単純に「（その臓器では）個体毎に目的遺伝子の発現が異なっている」 と解釈するのが自然だと思うですけど、そう判断されないのは どうしてなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1258-4 - 2011/11/26 (土) 16:31:14 - 7744 ＞初心者１ だめ。 質問が論外。

(無題) 削除/引用 No.1258-3 - 2011/11/26 (土) 15:22:31 - 初心者１ 質問に質問をかぶせてしまい申し訳ありませんが、詳しい方のご意見を知りたいのでお願いします。 今回のような、 １．臓器Aではバンドが見られる ２．臓器Bではバンドが出たり出なかったりする ３．臓器A,Bともにアクチンのバンドは見られる 場合に 結果１、３から「実験自体は上手く行っている」と考え その上で結果２より、「臓器Bでの発現は低い」と考える ことは良いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1258-2 - 2011/11/26 (土) 13:30:46 - xyz PCRの増幅効率が悪いと、低発現量域のPCRの再現が悪くなります。 Real-Time PCRだと、視覚的にわかりやすいのですが、 測定誤差が大きくなってしまうため、 得られるデータの信頼性がかなり低いことになります。 PCRの増幅効率に関わるのは、 プライマーの配列、増幅領域、PCR溶液の各試薬の濃度、PCR条件、PCR試薬、PCRの機械、 など、もろもろの複合条件によります。 従って、 PCRの条件を、プライマーの設計なども含めて 見直した方が良いのではと思います。

RT-PCRの結果の再現性が悪い原因について 削除/引用 No.1258-1 - 2011/11/26 (土) 13:02:52 - 学生 お世話になっております。 私は現在学生として研究に携わっております。今回が初めての投稿なのですが何卒よろしくお願いいたします。 現在、 「マウス各臓器での目的遺伝子の発現解析」 をRT-PCRによって行っているのですが、臓器によって結果の再現性が悪く、原因等についてお心当たりのある方がいらっしゃいましたらご助言等頂けますと幸いです。 「結果の再現性が悪い」というのは、「コントロールとして置いた遺伝子（今回はβ-actin）のPCRは走っているにも関わらず、サンプル（すなわち別個体由来の臓器）によって目的遺伝子のバンドが見えたり見えなかったりする」という意味です。 特に目的遺伝子の発現量があまり高くないと思われる臓器でこの傾向が見られるように思います。 RT-PCRの実験の手順と致しましては マウスより臓器を摘出 ↓ フェノール系の試薬（カイノス社Ultraspec）にてtotalRNAを抽出 ↓ DNAse処理後totalRNAを精製 ↓ 逆転写 ↓ PCR反応 というのが大まかな流れです。 コントロール遺伝子（今回はβ-actin）のPCRが問題なく走っていることからcDNAの合成まで出来ていると思われるサンプルにも関わらず、サンプルによって目的遺伝子のPCRではバンドが見えたり見えなかったりする、というようなことはあり得るのでしょうか？ 原因等についてお心当たりのある方がいらっしゃいましたらご助言等頂けますとありがたく思います。よろしくお願い致します。

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