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(無題) 削除/引用 No.1255-4 - 2011/11/26 (土) 03:21:38 - spp 以後の実験に合うかどうかよく分かりませんが spheroplast化した後にビーズで壊したり spheroplast化して別の方法で壊したりすれば 粉砕のやり過ぎと言う心配は減るかもしれませんね

(無題) 削除/引用 No.1255-3 - 2011/11/26 (土) 01:05:51 - ABZO 酵母から蛋白質抽出するのはほんと並大抵ではないよ。（やればそれなりに何か取れる事は取れるけど、総蛋白質という意味では抽出出来ない蛋白質が多い。）あれの細胞壁はうちらが想像する以上に固い。細菌とかの比でない。SDSでも壁溶けなくて抽出に抵抗性のもの多い。還元剤とNaOH中で抽出（細胞壁の成分のなんかがアルカリに弱いらしい）とかかなり極端なことしないと難しい。あと酵母はprotease活性も高いので、抽出操作に時間がかかるとそれも心配だね。 あとでこれ読んでみれば。 http://openwetware.org/images/0/01/Kushnirov.pdf

(無題) 削除/引用 No.1255-2 - 2011/11/25 (金) 18:53:43 - aimar 破砕が過剰だと思います。 酵母はプロテアーゼ活性が強いので、プロテアーゼインヒビターを入れていても結構分解します。 １回、２回、、、と様々な条件で検討するとよいと思います（破砕の強さもかえられるのなら破砕の強さも）。 インヒビターを濃く加えるのもありだと思います、

酵母のタンパク質抽出(grass beads法)について 削除/引用 No.1255-1 - 2011/11/25 (金) 15:41:41 - たんぱく初心者 目的のタンパクを発現させるプラスミドを形質転換した酵母を用いて、Lysis buffer (Tris-HCl pH8.0 100mM　NaCl 150mM　EDTA 1mM　Triton X-100 1%) に懸濁し、grass beadsを加えて、mini bead beaderで 5000rpm 30秒→冷却を繰り返し、顕微鏡で細胞がおおよそ破砕できるまでこの操作を行っています。大体７，８回は繰り返します。 遠心後、lysateを取り、ウェスタンで確認するのですが、かなりの量を流しても、目的のタンパク質を検出することができません。これは、lysis bufferに目的のタンパク（転写因子で、基本的には細胞質に局在します）が溶解しないのか、あるいは、粉砕のやり過ぎで、何か問題があるからなのでしょうか？PI mix, PMSFは加えて、プロテアーゼも抑えているつもりなのですが…。 ちなみに、アルカリ法で抽出後、TCA沈殿、SDS sample bufferで懸濁したサンプルからは目的のタンパクがウェスタンで検出できますので、発現に問題があるわけではないと思われます。 この後、GST-pull downを行いたいので、grass beadsでの破砕を選択しております。 どうかご教授ください。

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