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(無題) 削除/引用 No.1252-5 - 2011/11/24 (木) 18:50:14 - snow 皆様ありがとうございます。 kodamataro様 確かにreal time を使うのが理想かもしれませんね。 標的遺伝子はある薬剤の処理によって相対発現量0.5以下程度には低下すると予測しているのですが、 その程度の差を拾うのであればやはりRT-PCRでは難しいでしょうか？ ＞プライマーなしのプレミックスを作成して、各ウェルに分注 　ウェルにプライマーを1つずつ丁寧に加えるという方法を取っています。 これはプレミックスにはcDNAも加えておくという事なのでしょうか？ 7744様 ＞サンプルを希釈して5μlぐらい入れる方が少しはましだと思いますよ。 　有り難うございます。早速試してみます。 mon様 ＞温度変化にムラがあるブロックもあるそうです。　 　毎回中心部にチューブを配置しているのですが...... thermal cycler が旧式のようなので、少し心配ですね...... 同じチューブの中に、内部標準と標的遺伝子のブライマーを一緒に入れてしまい、 泳動したときに現れる２つのバンドを基準に定量する、という方法はどうでしょうか？ これならcDNAをチューブに入れる際の誤差の可能性を排除出来るのではないかと思うのですが.....

(無題) 削除/引用 No.1252-4 - 2011/11/24 (木) 17:08:51 - mon 温度変化にムラがあるブロックもあるそうです。 つまりPCRチューブをどのあたりに立てるかで、増幅効率が変わる機器もあるようです。 いつも同じ場所（中心部あたり？）に立てるとよいそうです。

(無題) 削除/引用 No.1252-3 - 2011/11/24 (木) 11:42:38 - 7744 サンプルを希釈して5μlぐらい入れる方が少しはましだと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.1252-2 - 2011/11/24 (木) 09:14:31 - kodamataro 理想的なのはリアルタイムPCRを使うことだと思います。 リアルタイムPCRを行うときは、私は プライマーなしのプレミックスを作成して、各ウェルに分注 ウェルにプライマーを1つずつ丁寧に加えるという方法を取っています。 サンプルが1.0μlなのか、1.1μlなのか、でも結果は大きく変わってしまうと思うのです。

半定量PCRの再現性について 削除/引用 No.1252-1 - 2011/11/23 (水) 23:22:22 - snow いつもお世話になっております。 現在RT-PCR法による半定量を行っています。 内部標準はGAPDHを使い、バンドの濃さを基準として ある遺伝子の相対的発現量を比較しているのですが、 同じサンプル、同じサイクル数で繰り返しても、 パターンが一致せず困っています。 GAPDH用と標的遺伝子のpremixをそれぞれ用意し、 そこにサンプルを1μlずつ加えて、という方法で やっています。 逆転写するときのRNA量は100ngで揃えています。 皆様の知恵をお貸しください。 よろしくお願い致します。

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