BioTechnicalフォーラム [ヒアルロン酸組織染色での疑問点]

ヒアルロン酸組織染色での疑問点

No.1243-TOPIC - 2011/11/21 (月) 22:02:45 - Anakin

免疫染色に重点を置いて日々実験しています。

ビオチン標識したヒアルロン酸抗体を用いて組織染色をした際に、非常に綺麗な蛍光二重免疫染色データを得ることができました。

ですが論文を読んでいると、放散菌から分泌されるヒアルロン酸の分解酵素（ヒアルロニダーゼ）で前処理してからビオチン標識したヒアルロン酸抗体を用いて組織染色を施行するネガティブコントロールを呈示しています。

”お作法”と言われるとそこまでかもしれませんが、なぜ他のECM（オステオポンチンやフィブロネクチン）の免疫染色と異なり、ヒアルロン酸ではわざわざ分解酵素処理する「ネガティブコントロール」が必要なのか御教示頂けると幸いです。
　

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(無題)

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No.1243-8 - 2011/11/25 (金) 16:29:19 - Sandiegan

すいません。

＞私が使ったのは高分子量のヒアルロン酸を認識する抗体です。
＞ビオチン標識のヒアルロン酸結合蛋白（HABP）に対する抗体です。
ここのところがちょっと理解しきれておりません。

高分子のヒアルロン酸を認識する抗体（サブクラスIg？）を用いての免疫染色
であれば、"お作法"として同じサブクラス（Ig？）のネガティブコントロールが必要です。

私どもが行っているのは、ビオチン標識したHABPを抗体の代わりに使用する方法です。

即ち、組織サンプルのヒアルロン酸にビオチンHABPを結合させ、アビジン標識酵素を反応させた後、基質を加えて発色させます。
この反応系で、サンプル上のヒアルロン酸をヒアルロニダーゼで消化し、HABPとの反応性をなくすこと特性を確認できることになります。
これはヒアルロン酸を検出する際のいわゆる"お作法"と考えていただければ間違いありません。

アビジン標識酵素にperoxidaseを用いたりすると内在性のPODを抑えるための"お作法"もあります。

http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2011/biotechforum.cgi?mode=view;Code=839

お役に立てば幸いです。

(無題)

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No.1243-7 - 2011/11/23 (水) 19:32:29 - 月詠

免役組織染色を重点的に勉強されていらっしゃるのであれば、当然、
陽性反応が一次抗体の非特異的な結合ではないことを証明するための陰性対照も
併せて提出することが”お作法”になっていることは承知のことと存じます

わたしも細胞外マトリクスについては門外漢ですのでお伺いしたいのですけど、
なぜオステオポンチンやフィブロネクチン等の免疫染色では、そのような陰性対照の
データが未提出の”無作法な”論文がacceptされてしまっているのでしょうか？
染色技法の引用文献中にすでに示されている、あるいは常用されている著名な
抗体クローンなのでもはやその必要もないということなのでしょうか？

一方、抗ヒアルロン酸抗体は新たに樹立されたハイブリドーマに由来しているため、
”お作法”通り、陰性対照のデータが併記されていたということなのでしょうか？

ＥＣＭ業界には詳しくありませんので、わたしだったら、
基本的にそのような”無作法”な論文のデータは、
いかに掲載誌のインパクトファクターが高かろうと、
俄かに信用するには値しない、と判断しますけどね…

今後やる予定なので勉強中

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No.1243-6 - 2011/11/23 (水) 18:32:12 - Boston-Pullman

ビオチン標識のヒアルロン酸結合蛋白（HABP）に対する抗体を用いた場合、組織を固定してからヒアルロニダーゼ処理してもシグナルが消えるのでしょうか？

Sandieganさんがコメントされているビオチン標識のヒアルロン酸結合蛋白（HABP）の方法を論文で読んだので、この方法が一般的なのかなと思っていました。

ついでに、エンドトキシンフリーのヒアルロン酸ご存知の方おられましたら、メーカーを教えて頂けないでしょうか？やはり医療用のものになるのでしょうか。

ビオチン標識のヒアルロン酸結合蛋白（HABP）

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No.1243-5 - 2011/11/22 (火) 17:14:15 - Anakin

私が使ったのは高分子量のヒアルロン酸を認識する抗体です。
ビオチン標識のヒアルロン酸結合蛋白（HABP）に対する抗体です。
やはりglycochainであるということから、根本的に他のECM分子とはウェスタンブロットであろうと免疫染色であろうと、分解酵素によるネガティブコントロールが必要なんでしょうか？

ヒアルロン酸染色は抗体？

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No.1243-4 - 2011/11/22 (火) 14:01:11 - Sandiegan

お伺いしますが、お使いになった試薬は「ビオチン標識の抗ヒアルロン酸抗体」なのですか。
ヒアルロン酸に対する抗体はないと思いましたが。（知らないだけかもしれませんが）
ビオチン標識のヒアルロン酸結合蛋白（HABP）と呼ばれるものではないでしょうか。

ヒアルロン酸はグリコサミノグリカンと呼ばれる糖鎖であり、オステオポンチンやフィブロネクチンと言ったタンパク分子とはことなります。
そのため、抗体ができない、あるいは非常にできにくいものです。
そこで、私どもでは上記HABPにてヒアルロン酸を検出しております。
そのために、ヒアルロニダーゼで処理するコントロールを用いております。
オステオポンチンやフィブロネクチンの免疫染色では、コントロールとして同じクラスのIgを用いているはずです。

(無題)

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No.1243-2 - 2011/11/21 (月) 22:35:12 - Harmonia

門外漢なので質問。

他のECMでは、どういうネガティブコントロールがお作法でしょうか？
オステオポンチニダーゼやフィブロネクチニダーゼ（というのが有るか無いかしらないですが）を使わないのはなぜでしょうか？

ヒアルロン酸組織染色での疑問点

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No.1243-1 - 2011/11/21 (月) 22:02:45 - Anakin

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