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inverse PCRが上手くいきません・・・。 トピック削除
No.124-TOPIC - 2011/03/07 (月) 19:38:49 - ちえびあん
はじめまして。現在修士課程1年目です。
土壌から見出した放線菌が産生する酵素の遺伝子塩基配列を調べています。部分塩基配列は出せたのですが、未知配列をinverse PCRを使って調べようとしていますが、inverse PCRが上手くいきません。
実験手順を書きますので、ご意見・ご指摘などをよろしくお願いします。

【制限酵素処理】
抽出DNA（5μg)をBamHT,BglU,EcoRT,HindV,MflT,XbaTで30 or 37℃,3時間反応⇒イソプロパノ−ル沈殿、エタノール沈殿し、滅菌水10μLに溶解し、濃度測定。

【セルフライゲーション】
制限酵素処理DNA 5μL(200ng)とLigation solutionT 5μLの計10μLを16℃、30min反応⇒イソプロパノール沈殿、エタノール沈殿し、滅菌水5μLに溶解。

【PCR反応】
セルフライゲーション産物 5μL
LA Taq 0.5μL
2×GC Buffer T 25μL
dNTP mix 8μL
primer F　1μL
primer R 1μL
滅菌水　9.5μL

【PCR条件】
1, 95℃　3min
2, 95℃　30sec
3, 55℃　15sec
4, 72℃　1.5min
　2〜4を40サイクル
5, 72℃　5min

PCR条件に関しては上記の条件で部分配列が増加しました。
1回だけ、上記の手順でinverse PCRを行ったところ、バンドが確認できた（予想される位置に）のですが、それ以来バンドの泳動パターンが変わってしまいました。
制限酵素の種類が違うので、断面が違うはずなのですが、すべて同じように不得意なバンドが出てしまいます。（スメアーほどではないですが、バンドが10本くらい出ます・・・。）
試薬や滅菌水、プライマーも調整し直しましたが駄目でした。DNAの再抽出を行い、新しいDNAサンプルを使っても駄目でした。

自分の勉強不足と経験のなさは十分承知しております。どうかご意見・ご指摘をよろしくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.124-6 - 2011/05/16 (月) 17:17:29 - ひこ
その後、実験は上手くいっていますでしょうか。
遅ればせながら、アドバイスをさせていただきます。

私も以前、inverse PCRを行ったことがあります。

普段, うちのラボではPCR酵素としてrTaqやKOD、KOD　plusなどを使っていますが、inverse PCRのときは、PrimeSTARを使いました。
これは増幅配列が長い時に有効だそうです。
試行錯誤もなく、1度の実験で成功しました。
もちろん、一段階で。

参考になれば幸いです。

ご意見ありがとうございます。 削除/引用
No.124-5 - 2011/03/08 (火) 11:48:27 - ちえびあん
おおさん、APさん
お忙しい中、わざわざアドバイスをして頂きありがとうございます。

まずLigation時のDNA濃度を下げてみます。

inverse PCRはやはり一段階では上手くいかないのですね・・・。

一度だけ増えたのは何かの拍子だったのでしょうか？
XbaTとBglUに500bpほどの増幅が確認でき、残りの未知配列が約250塩基だったので、上手くいったと思ったのですが・・・。

nasted PCRをやることも考えてみます。

(無題) 削除/引用
No.124-4 - 2011/03/07 (月) 23:27:13 - おお
In addition, you might want to make sure that the DNA is completely digested. It depends on how you purify DNA, but it may not be pure enough to be digested.

If you have a primer set by which you can amplify very small fragments cross the ligated junction -- maybe 100 bases around --, you can check if ligation is successful or not.

(無題) 削除/引用
No.124-3 - 2011/03/07 (月) 22:11:32 - おお
>[Re:2] APさんは書きました :
> 自己環状化するためのligationはDNA濃度が低い方がいいです。DNA量を減らすか、volume-upするかして、もっとDNA濃度を下げたほうがいいかもしれません。
I would suggest the same thing as AP san said.

(無題) 削除/引用
No.124-2 - 2011/03/07 (月) 21:27:56 - AP
自己環状化するためのligationはDNA濃度が低い方がいいです。DNA量を減らすか、volume-upするかして、もっとDNA濃度を下げたほうがいいかもしれません。

それと、inverse PCRは一段のPCRでうまくいくとは思わないほうがいいでしょう。nested PCRするのが当たり前といっていいのではないでしょうか。

inverse PCRが上手くいきません・・・。 削除/引用
No.124-1 - 2011/03/07 (月) 19:38:49 - ちえびあん
はじめまして。現在修士課程1年目です。
土壌から見出した放線菌が産生する酵素の遺伝子塩基配列を調べています。部分塩基配列は出せたのですが、未知配列をinverse PCRを使って調べようとしていますが、inverse PCRが上手くいきません。
実験手順を書きますので、ご意見・ご指摘などをよろしくお願いします。

【制限酵素処理】
抽出DNA（5μg)をBamHT,BglU,EcoRT,HindV,MflT,XbaTで30 or 37℃,3時間反応⇒イソプロパノ−ル沈殿、エタノール沈殿し、滅菌水10μLに溶解し、濃度測定。

【セルフライゲーション】
制限酵素処理DNA 5μL(200ng)とLigation solutionT 5μLの計10μLを16℃、30min反応⇒イソプロパノール沈殿、エタノール沈殿し、滅菌水5μLに溶解。

【PCR反応】
セルフライゲーション産物 5μL
LA Taq 0.5μL
2×GC Buffer T 25μL
dNTP mix 8μL
primer F　1μL
primer R 1μL
滅菌水　9.5μL

【PCR条件】
1, 95℃　3min
2, 95℃　30sec
3, 55℃　15sec
4, 72℃　1.5min
　2〜4を40サイクル
5, 72℃　5min

PCR条件に関しては上記の条件で部分配列が増加しました。
1回だけ、上記の手順でinverse PCRを行ったところ、バンドが確認できた（予想される位置に）のですが、それ以来バンドの泳動パターンが変わってしまいました。
制限酵素の種類が違うので、断面が違うはずなのですが、すべて同じように不得意なバンドが出てしまいます。（スメアーほどではないですが、バンドが10本くらい出ます・・・。）
試薬や滅菌水、プライマーも調整し直しましたが駄目でした。DNAの再抽出を行い、新しいDNAサンプルを使っても駄目でした。

自分の勉強不足と経験のなさは十分承知しております。どうかご意見・ご指摘をよろしくお願い致します。
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