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(無題) 削除/引用 No.1231-6 - 2011/11/20 (日) 20:41:50 - qq >だめなのではないかと思っていたのですが、調べると、別の種の同じタンパク質をJM109で精製しているのを見つけました。 、、、、そうですか。 JM109の場合Lonの作用を受ける可能性がありますから、JM109からBL21への選択変更は当然あるのですが、必要なければ、プラスミドprepの時に使って、そのまま温存しているJM109をそのまま発現誘導してみます。 ですから理由はありませんが、pGEXでは殆どJM109のまま誘導しています。 判りませんが、JM109でうまく行く本質的な理由が何かあるのかも知れませんね。

(無題) 削除/引用 No.1231-5 - 2011/11/20 (日) 14:53:42 - sc ＞qq 様 ありがとうございます。 同様の条件で空ベクターでは発現し精製できています。 また、今回数種の野生型と数種の変異型タンパク質（合計10種類）を精製しようとしているのですが、同様の条件で誘導がかかり精製できているものもあります。10種類中3種類（野生型1種類と変異型2種類）が上手く誘導がかからず精製できていません。 一点お伺いしたいのですが、BL21は誘導がかかりにくい等なにか難しい点はあるのでしょうか？ BL21はプロテアーゼを欠損したB株由来の菌株なので、BL21でだめなら他の菌株でもだめなのではないかと思っていたのですが、調べると、別の種の同じタンパク質をJM109で精製しているのを見つけました。 他の分子量の位置で若干の増加が見られているものもありますので、まずは抗GST抗体を用いて調べてみようと思います。 >[Re:3] qqさんは書きました : > 空ベクタでは発現しますか？ > pGEXなら、BL21でなくとも、JM109でも誘導発現できますから、本気で条件を最適化するまでは、BLでなくても良いかもしれませんよ。 > 目的の分子量以外のところでは大きく変化するタンパクはあるのでしょうか？ > GST抗体でチェックしてみるのも一つの手ではあります。

カイ様 削除/引用 No.1231-4 - 2011/11/20 (日) 14:36:19 - sc ＞カイ様 ありがとうございます。 OD値に関しては以前同じファミリー分子で精製している値を参考にしました。 今回数種類のタンパク質（野生型と変異型数種）を精製しているのですが、同様の方法で上手く誘導がかかり精製ができているものもあります。 ただ、たしかに今の条件で上手く言ってないので、通常の条件（OD＝0.3〜0.5）でためしてみたほうがいいかもしれませんね。 >[Re:2] カイさんは書きました : > IPTG入れるときのODが高すぎでは。 > 通常0.3〜0.5じゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.1231-3 - 2011/11/19 (土) 22:59:24 - qq 空ベクタでは発現しますか？ pGEXなら、BL21でなくとも、JM109でも誘導発現できますから、本気で条件を最適化するまでは、BLでなくても良いかもしれませんよ。 目的の分子量以外のところでは大きく変化するタンパクはあるのでしょうか？ GST抗体でチェックしてみるのも一つの手ではあります。

(無題) 削除/引用 No.1231-2 - 2011/11/19 (土) 17:23:14 - カイ IPTG入れるときのODが高すぎでは。 通常0.3〜0.5じゃないですか？

GSTリコンビナントタンパク質~誘導がかかりません。 削除/引用 No.1231-1 - 2011/11/19 (土) 16:37:15 - sc GSTタグのリコンビナントタンパク質を精製したいのですが、IPTGにより誘導がかかりません。 どのような改善策が考えられますでしょうか？ pGEX-6P ベクターに目的タンパク質のインサートを挿入し（シークエンスにて配列確認済み）をBL21にトランスフォーメーションし、生え てきたコロニーを10個ピックアップ。OD600：1〜1.1まで培養、0.1ｍM IPTG添加後37度3時間培養後SDS-PAGEで確認しましたが、どのクロー ンも目的の分子量の位置に発現増加がみられませんでした。 以下のことも試してみましたが改善が見られません。 �@IPTG濃度を0.5mMにあげる。 �A誘導後の温度を25℃に下げる。 �B反応時間を1時間に短縮、または5時間に延長。 何か良いアドバイス等ございましたらよろしくお願いいたします。

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