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Tag付きタンパクの発現について トピック削除
No.1219-TOPIC - 2011/11/16 (水) 16:01:28 - Toyo
Pulldown assayを行うため、幾つかのタンパクそれぞれにHis Tag、またはFlag TagをつけたPlasmidを作成しています。
Hisはうまくいったのですが、Flag Tagをつけたタンパクは発現しませんでした。
Sequenceを確認し、frameがずれていないことを確認しました。
確認はFlagの抗体を使ってウェスタンで行い、293cellsへのtransfection効率も問題ありませんでした。
Positive ControlのFlag付きタンパクはバンドが確認出来たので、抗体の問題でもないようです。
C末、N末側の２種類を作ってみましたが、どちらも発現していませんでした。
考えられる方法をやり尽してしまい、困り果てています。
助けて頂けると嬉しいです。みなさまどうかよろしくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.1219-14 - 2011/11/19 (土) 17:12:20 - Harmonia
分解されやすいタンパク質なら、SV40 ori があるベクターなら、HEK293T とかCos-1 とかのプラスミドが増える細胞に入れて、発現させて見ては？

ただし、Hisタグでうまく言っていると仰っているので、効果はないかも。
No.1219-8 の mAbさんの「Hisは偽陽性？」に答えておられませんが、その可能性は？

(無題) 削除/引用
No.1219-13 - 2011/11/18 (金) 09:27:23 - Toyo
皆様、貴重なご意見をありがとうございました。

>>Sequenceを確認し、frameがずれていないことを確認しました
>frameだけをチェックしたのでしょうか？
>変異が入るような方法（PCR)を使っていたら、全シークエンスを確認したほうが良いかも。
目的のタンパク部位+FlagはPrimerにTag のsequence、制限酵素サイトを入れてPCRで増やしました。
それをpcDNAのmulti-cloning siteに繋いでいます。
vector backboneのsequenceは確認していませんが、insert部分のmutationがないことは確かめました。

>transfection効率に問題ないというのはpositive controlに関してですか？
>問題となっているベクターが細胞内に入っていることはどのように確認されたのでしょうか？
transfectionをする際、蛍光タンパクのvectorをco-transfectionしております。
ご指摘の通り、目的のvectorが入ったかどうかの効率は分かりませんが、transfectionそのものはうまくいっているので、目的のvectorも発現しているものとして実験を進めていました。
vectorサイズはcontrol vectorも7kbpぐらいです。


これまで一度も経験したことがないのですが、もしかしたらpromoterにmutationが入ってしまったかも知れません。
pcDNAではなく、mammalian用の発現vectorに乗せ換えて再度挑戦してみます。

(無題) 削除/引用
No.1219-12 - 2011/11/18 (金) 07:22:40 - モモ
>Sequenceを確認し、frameがずれていないことを確認しました

frameだけをチェックしたのでしょうか？

変異が入るような方法（PCR)を使っていたら、全シークエンスを確認したほうが良いかも。

(無題) 削除/引用
No.1219-11 - 2011/11/18 (金) 06:36:59 - ab
endogenousのタンパク質と区別できるプライマーを設計できれば、RT-PCRで確認するのも一つの方法かと思います。
薬剤耐性遺伝子（あれば）が増えれば、トランスフェクションは上手くいっていることがわかるし、目的の遺伝子が増えれば、とりあえず転写まではできていることがわかります。
タンパク質が分解されているのか、その前に問題があるのか確認してから対処法を考えた方がよい
と思います。

(無題) 削除/引用
No.1219-10 - 2011/11/17 (木) 23:37:38 - み
>[Re:1] Toyoさんは書きました :
> 確認はFlagの抗体を使ってウェスタンで行い、293cellsへのtransfection効率も問題ありませんでした。
> Positive ControlのFlag付きタンパクはバンドが確認出来たので、抗体の問題でもないようです。

transfection効率に問題ないというのはpositive controlに関してですか？
問題となっているベクターが細胞内に入っていることはどのように確認されたのでしょうか？
positive controlと問題のvectorはinsertサイズはそれぞれどのくらいですか？ベクターサイズが大きくなると同様にtransfectしても殆ど入っていない可能性も考えられますが。
westernではなく免疫細胞染色でチェックすればtransfection効率の問題や発現量の問題は除外し易いでしょう。

(無題) 削除/引用
No.1219-9 - 2011/11/17 (木) 18:47:16 - mon
ベクターの構成にまったく問題がないとして、以下の経験があります。
フォールディングしづらいタンパクらしく、翻訳後直ぐにポリユビキチン化されて非常に早く分解されていたため、見かけ上発現していないように見えました。MG132などのプロテアソーム阻害剤を入れておくと、ウエスタンブロットで、コム〜高分子量の領域にスメアーなバンドが検出されました。
CMVではなくHSV-tkなどの弱いpromoterに変えると、発現量は少ないものの目的サイズのバンドが得られるかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.1219-8 - 2011/11/17 (木) 13:24:35 - mAb
思い当たることとして

１）発現が微量
２）Hisが実は偽陽性

１）ならば抗FLAG抗体でIP後、抗FLAG抗体で検出してみてはいかがですか。

２）抗His抗体は発現量が少ない場合偽陽性が多い印象を持ってます。大腸菌発現系ならば発現タンパクの含有量が多いため容易に判別可能ですが、哺乳細胞の一過性では難しい場合があります。陰性対照（ベクターのみもしくはmock）をきちんと取っているのであれば別ですが。

ご参考までに。

(無題) 削除/引用
No.1219-7 - 2011/11/17 (木) 10:13:02 - Toyo
はい、1st ATGの前にkozakもつけました。
GAATTCCACC ATGというようにEcoR1＋kozak＋ATG＋Flagの配列（N末の場合）にしております。

(無題) 削除/引用
No.1219-6 - 2011/11/17 (木) 09:58:38 - KY
pcDNAということはコザック配列はもともと入っていないと思いますが、
FLAGの前(C末にFLAGの場合は遺伝子の前に）コザック配列は導入しておりますでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1219-5 - 2011/11/17 (木) 09:42:53 - Toyo
pcDNAのvectorを使用しております。
293cellsでタンパクを発現させ、assayしようとしています。
IP前のinput 10ulを用いてwestern blotを行い、Flagの抗体でdetectを試みましたが、うまくいっていません。

(無題) 削除/引用
No.1219-4 - 2011/11/17 (木) 09:31:36 - KY
一応確認ですが、
pulldownということは大腸菌で最終的にFLAGタンパク質を発現させるのですか？
そのベクターは大腸菌発現用ですか？それとも哺乳類発現用ですか？両者は開始コドンが違うので、ちゃんとあっておりますでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1219-3 - 2011/11/17 (木) 09:16:41 - Toyo
手持ちの抗体を使いたいのでFlagにしました。
自分の考え方に間違いがあったり、見落としている点があると、他のtagに変えても同じように失敗するような気がしております。
ご教示賜りたく存じます。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用
No.1219-2 - 2011/11/16 (水) 20:22:50 - モモ
Flagにこだわらなくてもよいのでは？

Tag付きタンパクの発現について 削除/引用
No.1219-1 - 2011/11/16 (水) 16:01:28 - Toyo
Pulldown assayを行うため、幾つかのタンパクそれぞれにHis Tag、またはFlag TagをつけたPlasmidを作成しています。
Hisはうまくいったのですが、Flag Tagをつけたタンパクは発現しませんでした。
Sequenceを確認し、frameがずれていないことを確認しました。
確認はFlagの抗体を使ってウェスタンで行い、293cellsへのtransfection効率も問題ありませんでした。
Positive ControlのFlag付きタンパクはバンドが確認出来たので、抗体の問題でもないようです。
C末、N末側の２種類を作ってみましたが、どちらも発現していませんでした。
考えられる方法をやり尽してしまい、困り果てています。
助けて頂けると嬉しいです。みなさまどうかよろしくお願い致します。
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