全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

プラスミド保持率は簡単に調べれますよ？＾＾ 削除/引用 No.1217-10 - 2011/11/23 (水) 15:28:41 - 月詠 たしかにプラスミドを形質転換してアンピシリン含有の平板寒天培地に 播種した場合でも、プラスミド陽性の集落が生育してくると、 その集落の周囲のアンピシリン濃度が局所的に減少するために、 しばらく放置しておくと陽性コロニーの周囲に、プラスミド陰性の小さい集落、 いわゆるサテライトコロニーが形成されてきますよね また、選択圧がかからなくなった液体培地中では、プラスミドが脱落していく 現象も実際観察されます （脱落といっても、実際には、細胞分裂の際にプラスミドの分配を 受けれなかった娘細胞も増えるから、見掛け上、プラスミドを失った 菌が出現・増加してくるように観察されるのでしょうけど） 　 でも液体培地の場合、添加している抗生物質は基本的に過剰ですから、 ４時間程度の培養で選択効果が減弱するまでに分解されつくされてしまう ことはないと思います もちろん培養経過によって添加している抗菌薬がどの程度減少していくのか 測定したわけではありませんので、絶対ありえないとは申しませんけど… もし御心配でしたら、回収前の培養液を少しだけ採取して（十分希釈してから）、 抗生剤不含の非選択平板培地に播種して、生育してきた集落をたとえば１００個ほどを 滅菌つまようじで順番にアンピシリン含有平板培地にライブラリ状に接種してみれば、 元の培養液中の大腸菌のうち何％くらいがプラスミドが保持しているのかおおよそ確定しますので、 一度お調べになってみればよろしいのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1217-9 - 2011/11/19 (土) 17:35:54 - 中年 ミニプレップとのことですが、どのくらいの濃度のampを含んだ培地を、どのくらいの容量用いて、そこにどのように植菌して、どのくらいの時間培養していますか。 仰るようにβ-ラクタマーゼは培地に沢山放出されているので、ampの選択がかかっているのはせいぜい培地が濁り始めるまでだそうです。それ以降は選択なしに、プラスミドを持っている菌も持たない菌も増えることになります。ただし、先に書いたようにpUCが悪さをするわけではないので、持っていない菌が持っている菌の生育を凌ぐ理由もなく、当初の選択の結果である持っている菌がほとんどという状態が培養後期まで反映されると考えられます。

(無題) 削除/引用 No.1217-8 - 2011/11/19 (土) 00:36:01 - - ampicillinの分解を心配されているのであれば、 carbenicillinを使ってみるという手がありますよ。

(無題) 削除/引用 No.1217-7 - 2011/11/18 (金) 22:57:45 - ばいや DH5α-pUC19は私も収量が悪いです。 他のプラスミドに比べて1/3から1/10しか取れません。 pBluescriptもpUCよりましですが、収量は悪いです。

(無題) 削除/引用 No.1217-6 - 2011/11/17 (木) 15:24:40 - シリウス ＞問題はpUC18を含んだ大腸菌のみを増やせるか。と言う事です。 ampicillin耐性を持っているため, ampicillinを分解する酵素 が培地中に多く含まれていると考えられます。この事から,pUC 18を含まない大腸菌が多く培地中に存在し, pUC18の収量が低い のではないかと思いました。 アンピシリンが早々に消費された結果、アンピシリン耐性遺伝子を持たない大腸菌が増えてきた可能性（言い換えれば、セレクションが出来ていない可能性）を考えているのでしょうか？ もし、そうであるのならば、培地交換ではなく、アンピシリンをある一定時間ごとに追加したりすればよいのではないでしょうか？ 私は、大腸菌が増えにくい遺伝子をトランスフォーメーションした時、そのようなアンピシリン追加作戦（遺伝子によっては1時間ごと）を実行しています。 結果として、目的遺伝子を持たない大腸菌の増殖抑制と収率アップが望めます。 お役に立てば、幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1217-5 - 2011/11/17 (木) 13:21:30 - もぐもぐ βラクタマーゼはペリプラズム内にとどまっているのでは？だとすれば、溶菌しない限り培地中には漏れ出さないはずです。前提が間違っていたらすいません。

(無題) 削除/引用 No.1217-4 - 2011/11/17 (木) 12:51:02 - A ご回答有難う御座います。 問題はpUC18を含んだ大腸菌のみを増やせるか。と言う事です。 ampicillin耐性を持っているため, ampicillinを分解する酵素 が培地中に多く含まれていると考えられます。この事から,pUC 18を含まない大腸菌が多く培地中に存在し, pUC18の収量が低い のではないかと思いました。 >>インサートを含まないpUC18ということでしょうか。 インサートは含みません。バックボーンベクターです。

(無題) 削除/引用 No.1217-3 - 2011/11/16 (水) 21:14:18 - 中年 インサートを含まないpUC18ということでしょうか。それでしたら、大腸菌の増殖に悪さをするわけでもありませんので、培地交換で収率が上がるとは思えません。

(無題) 削除/引用 No.1217-2 - 2011/11/16 (水) 11:51:43 - ~ 目的は培地交換の影響についての知見なのでしょうか？それとも、収量のアップなのでしょうか？ また、どこにリミットがある場合の収率なのでしょうか？ 使用培地量がリミットであれば、 2倍量の培地量で最終培養を行う場合よりも、 1倍量の培地量で途中で交換した場合の方が収量は少ないでしょう。 培養スケールや使用原料量がリミットであれば、 途中で使用原料を半分捨てるよりも、 Yeast extract濃度等を2倍にして最終培養を行った方が収量は増えるでしょう。 http://kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=380

ミニプレップ時の培地交換について 削除/引用 No.1217-1 - 2011/11/16 (水) 10:55:17 - プラスミド DH5α-pUC18の培養を行なっています。 選択はampicillinを用いて行なっていますが,培養4時間程度 経過後の培地交換は収率アップに効果があるでしょうか。 ご存知の方いらっしゃいましたらご助言お願いします。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---