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(無題) 削除/引用 No.1213-2 - 2011/11/16 (水) 09:41:27 - ~ プレートに塗ったPCR産物をコロニーPCRで増やしただけなのでは？ 遺伝子のプライマーでコロニーPCRをするのはリスキーです。 疑うのは遺伝子のプライマーの結果の方でしょう。 インサート内部の配列と、ベクター側の配列をそれぞれプライマーにすると、ライゲーションされた配列のみが増えるようになります。 ただ、今から大腸菌を増やして、夕方にミニプレップ+XbaI処理すれば、明日の朝にはインサートが入っているかと、インサートサイズの情報が得られるのではないでしょうか。

pBI121 削除/引用 No.1213-1 - 2011/11/15 (火) 18:58:20 - fire pBI121というベクターにサブクローニングしようと思っています。 プライマーにXbaIサイトを付加してPCRした後、XbaIで制限酵素処理したものを、 XbaI処理後にBAP処理したpBI121にライゲーションして大腸菌に形質転換しました。 得られたコロニーをコロニーPCRしたところ、 遺伝子のプライマーでは的確なサイズの増幅断片が見られましたが、 クローニングサイトの外側に作ったプライマーでは目的のサイズでもなく、 インサートが挿入されてもいないと考えられるサイズのバンドでもないサイズのPCR断片のみが得られました。 このことから、用いたプライマーがうまくいってないと考えられます。 pBI121のベクターにインサートが入っているかどうか確認するときに使っているプライマーの配列とかをご存知の方は教えてもらえませんか？

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