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BrｄU染色 トピック削除
No.1204-TOPIC - 2011/11/12 (土) 06:39:55 - 免疫染色
　お世話になります。

　BrdUの蛍光染色がうまく行きません。以前も何度か失敗して困ったのですが、Oxford Biotechnologyの抗BrdU抗体を使用して出来るようになったところでした。2N塩酸10分で処理していました。

　環境が変わり、Cell Signalingの抗体を使用しているのですが、推奨プロトコール通りにやってみても染まりません。塩酸処理をしてみても、推奨のクエン酸処理（高温で10分）をしてみても染まりません。

　BrdU投与がうまく行っていない可能性は考えにくいので、何か注意すべき点があればご教示ください。抗体を買いなおすのがいいのでしょうか。

　よろしくお願いいたします。
　
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No.1204-5 - 2011/11/14 (月) 11:22:44 - toyo
しばらく前、培養細胞でBrdUを使って実験をしていました。
培養細胞のお話なので、組織には適用できないかもしれないということをあらかじめお断りしておきます。

手元の資料によると、うちでは
Thermo #841202 Cellomics brdU cell proliferation kit
を使っていたようです。
また、BrdUを使った論文はたくさん出ていると思いますので、一度調べてみてはいかがでしょうか。

私の場合は、保存条件が悪かったのか、抗体のロット毎のばらつきが
大きくて困っていました。
同じところのkit(抗体含む)を何回か買い直しましたが、安定しなかったので、結局
Invitrogen MP10350 Click-iT EdU HCS Assays
に乗り換えてしまいました。
色素のサイズが抗体よりも小さいので、塩酸などでDNAをほぐしてやる必要がない点や、S/N比が高い点など、結果が安定しやすい印象がありました。
ただ、BrdUと完全に同じ結果が得られるとは言い切れないと思いますので、過去の実験結果と突き合わせる必要がある場合には、気軽に乗り換えられないかもしれません。。。

ありがとうございます 削除/引用
No.1204-4 - 2011/11/14 (月) 06:37:22 - 免疫染色
　ありがとうございます。

　塩酸処理はうまくいかなかったんですよね。組織でやっていますが、細胞でも本質は同じだと思いますので、参考にさせて頂きます。

　この抗体を普段使って問題ないよ、などございましたよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用
No.1204-3 - 2011/11/13 (日) 18:57:41 - KY
むかーし行っていた方法は（5年以上前の学生時代に）
BrdUを取り込ませた培養細胞を70%エタノールで固定して、1.5N HClで30分DNAを変性させてから、染色しておりました。
でも論文を見た限りではDNAの変性は他にも方法があると思うので、一番きれいに染まる方法を自分で試してみるといいと思います。
ポジコンではなく、ネガコンはAphidicolinなどでDNA合成を抑制した細胞などを使っておりました。
基本的に普通の培養細胞なら数時間の取り込みなら20-30%がＳ期なので、それがポジコンになると思います。

(無題) 削除/引用
No.1204-2 - 2011/11/12 (土) 09:53:00 - Harmonia
回答ではなく、ぼくも知りたいので。（実験する予定はありません）

BrdU 染色のポジティブコントロールって、何でしょうか？

うまくいっている実験区と見たい対象区なら、簡単ですが、
初めてやるときは、何がポジティブコントロールになりますか？

抗体が大丈夫かどうかは、BrdU の段階希釈をメンブレンに滴下して、抗体力価の定量ができますか？

１次抗体への２次抗体の反応性ならそのように検定できるけど。

BrｄU染色 削除/引用
No.1204-1 - 2011/11/12 (土) 06:39:55 - 免疫染色
　お世話になります。

　BrdUの蛍光染色がうまく行きません。以前も何度か失敗して困ったのですが、Oxford Biotechnologyの抗BrdU抗体を使用して出来るようになったところでした。2N塩酸10分で処理していました。

　環境が変わり、Cell Signalingの抗体を使用しているのですが、推奨プロトコール通りにやってみても染まりません。塩酸処理をしてみても、推奨のクエン酸処理（高温で10分）をしてみても染まりません。

　BrdU投与がうまく行っていない可能性は考えにくいので、何か注意すべき点があればご教示ください。抗体を買いなおすのがいいのでしょうか。

　よろしくお願いいたします。
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