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時間短縮 削除/引用 No.1192-21 - 2011/11/14 (月) 04:13:58 - jikan 時間短縮のためには、熱ショックタンパクの挙動をみる方法を工夫する方が効率がいいかもしれませんね（GFP付けたりとか、楽しい事ができそうです）。 食中毒関連で培養温度を調べている方もおられるようですね。例えばPredicting pathogen growth during short-term temperature abuse of raw sausageと言うのを見ると40.6度での生育が早いようです。sf様が使っておられる大腸菌も同じようなので、多くの大腸菌に見られる性質なのでしょうか？ ところで、Harmonia様のLB + 10% グリセロールとか25%とかは何のためにそんな実験をしたのでしょうか、すごく気になります。

ご回答ありがとうございます。 削除/引用 No.1192-20 - 2011/11/13 (日) 21:48:41 - sf >Harmonia様 私の実験系では25℃に比べ42℃でどれくらいHSPが 働くのかをみたいので実験区としては42℃、対象区 としては25℃といえます。 もっと具体的に言えればよいのですが。すみません。 私の実験系の細かい相談は指導教官等と議論し 質問を整理してからにしようと思います。 >もくもくさん様 貴重なご経験談ありがとうございます。 TS変異体も扱っているので考えさせられました。 低温培養も含め自分の実験を考えたいと思います。 >s様 >シリウス様 サンプルを大量に扱う実験系ですのでいったん プレートにまいたり等はなかなか難しい状態です。 しかし貴重なアドバイスありがとうございます。 >中年様 私が使用する株のプレート培養での結果では 37℃よりも40℃の方がコロニーが大きく増殖が 早かったです。 >み様 的確な返答ができず申し訳ありません。 私としてはHSPをターゲットとする場合、前培養の 温度を上げる例や経験等があれば実験系問わず 聞いてみたく質問しました。 >みなさま さまざまな回答ありがとうございます。 また返答が遅くなり申し訳ありません。 私自身、無知な自分が意見を求めているので 厳しい意見や突っ込みに関しては大事であると 考えます。もちろんここは私だけの場ではないので 誰が読んでもいいよう言葉は慎重に選ぶのも 大事であると考えます。 この場が回答してくださった皆様や読んでくださった皆様 の研究に少しでも役立てばと思います。 貴重なアドバイス、意見等くださった方本当に ありがとうございました。参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.1192-19 - 2011/11/12 (土) 19:19:36 - み >[Re:12] うさんは書きました : > そうそう別に無視すればいいのではないかと・・・。 > なぜムキになって、問い詰めなければならないのか。 > トピ主さんの質問の答えになってないし、何がしたいのかさっぱりわからない。 > 完全に煽りですよ。 あなたも無視してください。。。質問に対するコメントができないのなら。 さて本題に戻したいのですが、未だに質問の主旨が曖昧です。 単に時間短縮を求めるならs様の提案のように僕も種の割合を増やすのが良いと思います。 ちなみに僕は１００：１で種を本培養に添加して3時間培養し、IPTG誘導など行います。 勿論、バックボーンベクターの種類・hostの種類・Insert遺伝子の特性により時間などは微調整しますが。 主旨が2度上げることでHSPに影響を及ぼすかどうか？ならば、やはり答えようがないです。あなたが対象にしているHSPの種類が不明ですし、Host菌体種も不明。何の影響かもやはり不明ですし、あなたが行おうとしている実験と同様の経験を自分が行っているかどうかの判断ができない。 これは煽りではないです。質問の不明な部分を聞き出して質問に対する答えを提供したいというpositiveな書き込みです。

(無題) 削除/引用 No.1192-18 - 2011/11/12 (土) 18:59:46 - 中年 蒸し返すようで申し訳ありませんが、そもそも培養温度を39℃にすることで37℃のときより大腸菌の増殖が亢進するのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1192-17 - 2011/11/12 (土) 18:33:40 - シリウス mon様 色々な使い方があるのですね。 勉強になりました。 ありがとうございました。

本題とはなれますが、グリセロールについて 削除/引用 No.1192-16 - 2011/11/12 (土) 16:55:34 - mon グリセロールは炭素源ですので、栄養になります。合成培地やTB培地には含まれていますし、LBにも1~5%ほど添加しておくと菌体量は増えます。さらに1~2mM Mgも加えた方がより増えます。 一方、ライブラリーなどで沢山のクローンを凍結保存する場合などに、96wellプレート中LB+7%グリセロールで培養して、そのまま凍結保存もできます。

本題と離れつつありますが、一言・・・ 削除/引用 No.1192-15 - 2011/11/12 (土) 13:43:14 - シリウス ＞グリセロールという餌の量の変化 ？？？　意味不明です。 大腸菌を凍結傷害から保護する目的なのでは？ ＞LB + 10% グリセロールでは、DH10B は生えることはできますが、25%になると厳しい。 ？？？　これも意味不明です。 10％ or 25% グリセロール含有ＬＢで培養するということですか？ 私は、したことありませんが・・・ グリセロールストックを本培養に用いるとしたら、おそらく 500〜1000倍希釈することになるでしょうから、 残留グリセロール濃度は問題になりません。 ただ、グリセロールストックを使用する場合、一度、 プレートに撒きなおしてから、シングルコロニーを ピックアップして増やした方が無難です。 時間節約と思って、グリセロールストックを直接本培養に 使ったことが何度かあり、その時、 目的遺伝子を持たない大腸菌が大量に取れた経験がしばしば ありますので。 お役に立てば、幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1192-14 - 2011/11/12 (土) 09:45:17 - Harmonia どこまでの厳密さを求めているかによりますが、グリセロールストックは、 浸透圧の変化 グリセロールという餌の量の変化 が影響するかも。 LB + 10% グリセロールでは、DH10B は生えることはできますが、25%になると厳しい。 なので、ストレスを与えた状態での前処理、ということは否めない。

(無題) 削除/引用 No.1192-13 - 2011/11/12 (土) 03:03:35 - s どこから取って来て前培養用に植菌するのか知りませんが、植菌する量を増やせば時間の短縮はできるんじゃないでしょうか？プレートからならプレート全面に菌をはやしておいてかき集めるとか、グリセロールストックからなら液量を増やすとか。ダメ？？

(無題) 削除/引用 No.1192-12 - 2011/11/11 (金) 22:00:12 - う そうそう別に無視すればいいのではないかと・・・。 なぜムキになって、問い詰めなければならないのか。 トピ主さんの質問の答えになってないし、何がしたいのかさっぱりわからない。 完全に煽りですよ。

(無題) 削除/引用 No.1192-11 - 2011/11/11 (金) 21:41:29 - シリウス う様に同感です。 非難、煽り、禅問答のようなレスはやめませんか？ もくもくさん様のようにトピ主の実験に役立つような 回答をしたらどうでしょうか？ あまりにも回答する価値のない質問でしたら、 放置すればいいのではないでしょうか？

感覚的な話 削除/引用 No.1192-10 - 2011/11/11 (金) 21:26:01 - もくもくさん 昔、大腸菌のHSPとかTSの株を使っていました。 感覚的な話なんですが、上記の株にとって37℃や39℃は厳しい 温度みたいです。 野生株は37℃だと増殖が良いですが、それは変異がないからで 変異株は30℃以下が安全。 御存知のようにタンパク質の変性は42℃で急に起こるものではなく 37℃でも変性タンパク質が生じます。それを本培養に持ち越すのは ありがたくありません。 きちんとした結果を望むなら前培養も37℃や39℃ではなく本培養と 同じ25℃にするのがいいですよ。

(無題) 削除/引用 No.1192-9 - 2011/11/11 (金) 20:37:39 - Harmonia では対象区は？ 前培養が37℃でも39℃でも、どっちでもいいです。 それで出た結果を追従する人は、39℃を真似るべきです。 「おのずと答えが出る」と書いたのは、見たいものを見る手段として間違っていないかどうかを見極めてくださいということです。 もしかしたら、37℃からの培養では見えず、39℃からの培養なら見えるかもしれません。逆もありです。 だとすると、42℃だけが大事じゃないことになります。 37℃にするか39℃にするかの選択も大事だということになります。 その答えは、その比較をするトピ主さんにしかわかりません。あなたが見たいタンパク質は、あなたしか見ませんから。 で、対象区は？ 25℃の意味は？

(無題) 削除/引用 No.1192-8 - 2011/11/11 (金) 16:38:43 - う ここってトピ主を煽ったり説教したりするところなの？ 書きこむときは、よく考えようね。

ご返答ありがとうございます。 削除/引用 No.1192-7 - 2011/11/11 (金) 13:41:06 - sf >みなさま ご回答ありがとうございます。 私自身、39℃は高温であると認識しており前培養とはいえ なんらかの影響があると考えております。 ただ、本培養に投入する量が1/1000で、温度の影響は本培養の 方が大きいかもしれない。だとすればあらかじめ温度を 少し上げた状態で培養して培養時間の短縮を図るのはどうか。 前培養の温度の影響について詳しく知らないので思いつきで 申し訳ありませんがもしそのような実験をされた方、 もしくは知識としてお持ちの方がいれば聞いてみようと思い 質問しました。 >mon様 定常期の菌を用いるのは増殖が止まった菌を 用いたいからです。やはり熱ショックタンパクのような 温度が重要なファクターであるタンパクを対象としている 時は危険かもしれません。 >み様 もちろん通常のプロトコルである37℃に従うのがベスト と考えております。 ただもし前培養の温度が本培養に影響があるとすれば （ここでは）熱ショックタンパクの発現量、カイネティクスに どういった変化があるか、経験則等あれば教えて 頂ければと思いました。もし差し支えなければ み様の 考える/知識として蓄えてある「前培養の温度変化による 本培養の影響」について教えていただけないでしょうか。 >み様 >uuu様 私ももう少し質問する内容を整理すべきだったかも知れません。 >Harmonia様 前培養の温度（特に熱ショックタンパク）に関して影響が あるということを知らなかったので質問致しました。 もし前培養の温度が本培養時のタンパク発現や機能の向上が 見られるならこのファクターも検討すべきなのかなと 漠然と考えておりました。 実験系に関しては詳しく申し上げられないのですが42℃での 熱ショックタンパクの影響が重要です。 何分浅学故、知らない部分が多数あるので文献等自分なりに 調べます。

(無題) 削除/引用 No.1192-6 - 2011/11/11 (金) 08:34:56 - Harmonia トピ主さんは、皆さんに意見を求めて、その次どうするかを考えていますか？ 「影響がある」という答えがあったとき、37℃で培養するのでしょうか？ だとすると、37℃の意味は何でしょうか？ 「みんながやっているから」なのか 「ある文献があり、その実験の再現性の確認をかねて」 でしょうか？ 「みんながやっているから」なら、「みんな」ってだれですか？ 全くオリジナルではじめるのでなければ、なんらか前例があります。 その再現性と自らのオリジナリティーの比較が実験になるはず。 このように考えると、トピ主さんの質問の答えもおのずと出てくるはず。 そもそも、25℃と42℃のどちらが実験区でどちらが対象区ですか？

(無題) 削除/引用 No.1192-5 - 2011/11/11 (金) 01:16:02 - uuu >[Re:4] みさんは書きました : > 他の研究者が再現性とる時にその温度を真似ないといけないのでしょうか？ > それって迷惑な話です。 迷惑とかそんなこと知ったことではない。

(無題) 削除/引用 No.1192-4 - 2011/11/10 (木) 10:05:13 - み >[Re:1] sfさんは書きました : > > 私の実験系では本培養で熱ショックタンパクの挙動 > をみるのですが、39℃での前培養は本培養に影響が > あるでしょうか。 > そんな事聞かれても、あなたが対象にしている熱ショック蛋白が何なのか不明ですし、影響ないなんて誰も言えないです。2度違うのだから絶対になんらかの影響あるでしょう・・・。 そもそも「影響」って何に関しての影響？挙動ってどういう挙動？ あなた自信で検討してみる他ないと思いますが。 それに一般的なプロトコールでやらないと論文にする時に不都合生じると思いますが。Methodに正直に前培養は39度って明記されるのでしょうか？ 他の研究者が再現性とる時にその温度を真似ないといけないのでしょうか？ それって迷惑な話です。

(無題) 削除/引用 No.1192-3 - 2011/11/09 (水) 18:59:03 - mon 「前培養はsaturate」させる意味は、増殖を停止させることですか？ 定常期に入ると細胞内の状況がいろいろ変わりますから、再現性を得るためには、培養開始濃度・時間(増殖が停止してからの時間など）などを一定にしますよね？　長く定常期にすると死細胞もでてきますし。また単に菌数を沢山得たいなら、多めに培養して遠心濃縮すれば良さそうな。 熱ショックタンパクの挙動をみるのに、２度とはいえ温度上昇させるのは不適切でしょう。

補足です 削除/引用 No.1192-2 - 2011/11/09 (水) 12:44:28 - sf トピを立てたものです。 本文に抜けていた補足を追加します。 本培養での培養温度は 25℃と42℃です。 よろしく御願い致します。

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