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たしか、、、 削除/引用 No.1191-9 - 2011/11/11 (金) 14:43:06 - ema ＞ConAは直接T細胞を増殖させ、さらにIL-2レセプターの発現も促すという理解でいいでしょうか？ の様な考えで良いと思います。 ＞IL-2に関してなんですが、プロトコール通りに100mMの酢酸に溶かした後、希釈するのに培地に溶かしているのですがMilli-Q水などの方がいいですか？ Il2は各メーカー出していますが、私は薬剤部から人に使ってるrecombinant　humanIl-2を使える状況で、調整バイアルの”水”（ちゃんと溶けます）で50,000U/ml（試薬の調整指示）を作成し×1,000で１ボトル分づつ分注-20℃ストックでルーチンワークしています。 →NEAAも加えた方がいいのでしょうか。 SigmaのRPMI1640の標準調整で前述のものが全部入ってFullとして使用しています。 ＞75cm2フラスコで培養する 大量には使用しなかったので私は25cm2フラスコ（普通の横置き）で継代してました。 ＞5x10^5個 ？？？面積当たりとか(底面だとどうだっけ）、/mlでしか考えた事がないので、、、 最初につけた参考資料から、考えてみてください。 Subculture actively growing suspension cultures before they the reached 1 x 105 cell/ml. Use inoculation densities of 100 to 1000 cells/ml. Do not allow cells to exceed 1 x 105 cells/ml or IL-2 will be rapidly depleted and the cells will quickly lose viability.

(無題) 削除/引用 No.1191-8 - 2011/11/11 (金) 12:14:33 - masa あともう1つだけ質問させていただきます。 75cm2フラスコで培養する場合、継代する細胞数としてはどれくらいがいいのでしょうか。 僕は5x10^5個になるようにまいています。もう少しまく細胞数を振ってみようかなと思うのですが経験者の方がいればぜひお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1191-7 - 2011/11/10 (木) 17:35:22 - masa ConAはIL-2に対するポジコンとして絶対に活性化しているというので実験系でセッティングしていました。 →ConAはIL-2のポジコンになるのですか？全然知りませんでした。 IL-2がIL-2レセプターを刺激して細胞増殖させるのに対して、ConAは直接T細胞を増殖させ、さらにIL-2レセプターの発現も促すという理解でいいでしょうか？ 私も2-ME使い、継代は50U/mlでやってました。 →そうなんですね、論文には書いているものとそうでないものがあって、業者の説明文には特に記載もないので別に2-MEはいいかなと思っていたんですが。 IL-2に関してなんですが、プロトコール通りに100mMの酢酸に溶かした後、希釈するのに培地に溶かしているのですがMilli-Q水などの方がいいですか？ 「CTLL-2　培地」で検索すると TAKARA ・培地；PRMI1640（10％非働化牛胎児血清(FCS)、2 mM L-グルタミン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、50 mM 2-メルカプトエタノール 含有） 　　　　任意でペニシリン/ストレプトマイシンまたはゲンタマイシンを加える。 とあるので普通に入れると。 →NEAAも加えた方がいいのでしょうか。 質問が多くてすいませんがよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1191-6 - 2011/11/10 (木) 16:54:02 - ema ConAはIL-2に対するポジコンとして絶対に活性化しているというので実験系でセッティングしていました。 私も2-ME使い、継代は50U/mlでやってました。 「CTLL-2　培地」で検索すると TAKARA ・培地；PRMI1640（10％非働化牛胎児血清(FCS)、2 mM L-グルタミン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、50 mM 2-メルカプトエタノール 含有） 　　　　任意でペニシリン/ストレプトマイシンまたはゲンタマイシンを加える。 とあるので普通に入れると。

(無題) 削除/引用 No.1191-5 - 2011/11/10 (木) 13:32:06 - masa MPさん 回答ありがとうございます。 2-MEも入れるのですか？初めて聞きました。調べたところシステインの取り込みに関するもののようですが、入れないとgrowthが悪くなったり形質が変わってしまったりするものなのでしょうか？ 業者からのCTLL-2の注意書きに書いてなかったので使用していませんでした。

(無題) 削除/引用 No.1191-4 - 2011/11/10 (木) 12:11:08 - MP ConAはいらないです。IL-2は必須です。 あと2-MEも必ずいれてください。

回答ありがとうございます 削除/引用 No.1191-3 - 2011/11/10 (木) 11:08:50 - masa emaさんの言うとおり調べてみました。 そこでコンカナバリンＡを加えるといった論文も見受けられました。 確かに細胞分裂を誘発するマイトジェンということですが必要なんでしょうか。

調べてからね 削除/引用 No.1191-2 - 2011/11/09 (水) 14:05:50 - ema メジャーラインは調べる事が結構出来るのでそれでも判らなかったらね。 http://www2.brc.riken.jp/lab/cell/detail.cgi?cell_no=RCB0637 http://www.cell-lines-service.de/content/e174/e157/e2005/e1160/index_ger.html

CTLL-2培養条件に関して 削除/引用 No.1191-1 - 2011/11/09 (水) 11:07:48 - masa 僕は細胞から脂質を抽出してその特定の脂質の分析を行う研究をすることになりましたＭ１です。 浮遊細胞の培養経験がほとんどないため論文を調べながら実験を行っていますが正直今やっていることに自信がありません。 75cm2フラスコでCTLL-2を培養しています。 培地はRPMIに10%FBS,1%P/Sで100U/mLになるようにIL-2を入れています。 このIL-2の量も今後振ってみるつもりですが現段階では細胞も増えています。ただコンフルエント時の細胞数の目安などまだまだわからないことが多く自信がもてないのが現状です。 中１日で培養できるような系を構築したいのですが、この細胞について詳しい方いらっしゃいましたらご教授願いたいと思います。 素人質問ですみません。

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