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(無題) 削除/引用 No.1189-4 - 2011/11/10 (木) 04:19:51 - protein 皆様 アドバイスを頂き誠にありがとうございます。 実験はSYBR greenの系を用いていました。 はっきりとしたことが言えないということ、よくわかりました。 特にシグナルが産物の長さに依存することは全く見落としておりました。 大変参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.1189-3 - 2011/11/09 (水) 14:19:43 - qwerty >異なる遺伝子の間での量的な比較が可能か KYさんも仰っているように、 相対定量なので、難しいでしょう。 SYBR Greenの系だと、ddCtだけでは不可能です。 CT値が、PCR産物の長さにも依存しますので。 理論上、 同じ発現量だとすると、200bpsのPCR産物の方が 100bpsのPCR産物よりも、CT値が-1になりますので。 また、TaqManプローブを使った系だと、 FAMの蛍光強度が、すべての解析に使ったプローブ間で同じであり、 かつCT値の算出の仕方も、すべて同じであれば、可能でしょうが、 現実的にその「すべて同じ」を証明するのが難しいので、 異なる遺伝子の間で、発現量が多いだろう少ないだろうぐらいは示唆できますが、 何倍と数値化するのは、出来ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1189-2 - 2011/11/09 (水) 10:42:38 - KY deltaCTであろうとなかとうと相対定量であるのであれば、異なる遺伝子との発現量を議論するには確証がありません（もちろん個人的にはプライマーの増幅効率100%に近いことを確認しているのであれば、それぞれのDeltaCT値が発現量をある程度は反映しているとは思いますが）。 論文で議論するためには、既存濃度のサンプルからスタンダード曲線を作成し、絶対定量が必要になるでしょう。

realtimePCRのdeltaCTは発現コピー数を反映するか 削除/引用 No.1189-1 - 2011/11/09 (水) 09:34:01 - protein いつもお世話になっております。 この度、realtimePCRベースのフォーカスアレイを行いまして、 薬剤によりある血球系細胞を活性化させた際のサイトカイン／増殖因子の発現プロファイルを得ました。 教えていただきたいのは、各遺伝子のdeltaCt（house keeping geneでnormalizeした値）は、 その遺伝子の発現コピー数をある程度反映するのかということです。 別の言い方をすると、異なる遺伝子の間での量的な比較が可能かということです。 この実験の目的は、この血球系細胞自体の特徴付けを行うことであるため、 そのため刺激前後で何倍変化したかという情報に加えて、 実際にどのような液性因子を豊富に産生するかということまで考察できたらと考えています。 用いたプライマーなどはメーカーにより設計されたもので、 ddCt法での定量を目的としてものですので、増幅効率などは非常によりと考えています。 アドバイスをいただけたら幸いです。

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