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(無題) 削除/引用 No.1188-12 - 2011/11/16 (水) 10:07:31 - P 組織さん 返信ありがとうございます。 他のサンプルも同じように染色されてホッとしています。 一次抗体の推奨濃度にこだわりすぎたのでが失敗でした。勉強になりました。 またよろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.1188-11 - 2011/11/16 (水) 07:53:53 - 組織 >[Re:10] Pさんは書きました : > 腎臓の尿細管間質に陽性細胞らしき物がみられるようになりました 陽性細胞の分布は合っていると思います。あとは円形の細胞質や細胞突起などの細胞形態が確認できれば、マクロファージと断言してもいいんじゃないでしょうか。 >データシートやIHC worldなどでは50:1希釈が推奨されているのですが、一次抗体の希釈率が低すぎてバックが高くなって染まらないようにみえていたのかもしれません。 ラボによって検出系が違うので一概にはいえませんが、メーカー推奨の抗体濃度はたいてい濃すぎたりします。新しい抗体を購入した際は、初めに抗体濃度をふって実験しておくといいでしょう。メーカー推奨濃度とその10倍〜50倍くらいでしょうか。

結果 削除/引用 No.1188-10 - 2011/11/11 (金) 20:35:50 - P プロテナーゼK 0.1%にて抗原賦活化を試しました。 結果として、これまた最近染まらずに困っていた別の組織（脂肪）がきれいに染まるようになったものの、腎臓ではやはりバックグラウンドが高いままでした。一次抗体の希釈率を500:1に落としたところ、バックグラウンドが軽減され、腎臓の尿細管間質に陽性細胞らしき物がみられるようになりましたデータシートやIHC worldなどでは50:1希釈が推奨されているのですが、一次抗体の希釈率が低すぎてバックが高くなって染まらないようにみえていたのかもしれません。 あと二次抗体ー発色にニチレイのヒストファインの使用や過酸化水素処理の順番も検討してみます。 組織さん、ラスカルさん、アドバイスありごとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1188-9 - 2011/11/10 (木) 07:25:19 - 組織 あと、白血球マーカーなどある種のCD抗原では、過酸化水素処理によって抗原性が低下することがあります。こういう場合は、一次抗体と二次抗体の間に過酸化水素処理を行うことで、良好なシグナルが得られることがあります。私のラボではこの方法を採用しています。F4/80がどうだったかは覚えてないのですが、試してみる価値があるかもしれません．

(無題) 削除/引用 No.1188-8 - 2011/11/09 (水) 18:47:50 - P 組織さん、ラスカルさん、ありがとうございます。 プロK処理を試してみます。結果は後日報告します。 これで駄目なら抗体の問題かもしれないと考えているところです。

(無題) 削除/引用 No.1188-7 - 2011/11/09 (水) 18:28:44 - 組織 ああ、確認してみたら、私も酵素処理でやってますね。100 ug/mL proteinase K in 0.05M Tris (pH7.5)で室温10分反応させてます。よろしければご検討ください。 ただ、凍結切片でも染まらないというのが気になりますね。私は新鮮凍結の場合、アセトン：メタノール（1：1）混合液、4度，10分で固定してます。あとは二次抗体にポリマータイプ（ニチレイのシンプルステイン）を使ってますが、ABC法で駄目ということはないように思います。

(無題) 削除/引用 No.1188-6 - 2011/11/09 (水) 16:18:18 - ラスカル F4/80の賦活化は加熱より、酵素処理のほうが適していたと思います。 一度賦活化を変更してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1188-5 - 2011/11/09 (水) 15:55:10 - P 凍結切片は作成後当日、パラフィン切片も作成後１週間以内には使用しています。抗体は最近購入したので、死んでいる可能性は低いと思います。 CD31は以前から骨格筋の毛細血管評価で使用しており、きれいに染まることが確認できているものです。二次抗体や染色キットなどはF4/80の時も同じものを使用しています。 F4/80抗体のロット差はあるものでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1188-4 - 2011/11/09 (水) 12:21:28 - 組織 プロトコールに特に気になるところはないですね。切片は薄切・乾燥後、切りだめせずに、すぐに染色してますか？あと、F4/80抗体は新しいものですよね？ ちなみにCD31で染まっているものの特異性は確認されてますか？確か腎臓なら血管内皮細胞がそまったはずです。

(無題) 削除/引用 No.1188-3 - 2011/11/09 (水) 08:59:43 - P プロトコールですが １）キシレン代用液で5minx2 ２）100%エタノール3minx2 ３）70%エタノール3minx2 ４）PBSで浸水化 ５）抗原賦活：10mM citrate buffer pH6.0で95℃x10-20min→冷却20min ６）内因性ペルオキシダーゼ除去：3%H2O2 5-10min RT ７）ブロッキング:DAKOのblocking reagent 30min RT ８）一次抗体反応:抗体希釈液1% BSA in PBS 4℃　O/N (25:1-500:1) ９）二次抗体反応：30-60min RT (100:1-400:1) １０）アビジンービオチン複合体反応(DAKO LSAB)　30min RT １１）DAB発色(Vector Lab) が基本です。各行程間はPBS洗浄 2-3minx2が入っています。 組織のパラホルム固定は４℃でO/N-72hrs行った後パラフィン包埋しています。抗原賦活はイムノセーバーやLAB solutionという出来合いのものも試しましたが結果は同じでした。抗体希釈濃度もいろいろ変えましたが、結果は変わりませんでした。新鮮凍結切片でも試しており、４％パラホルム or アセトンで10min固定して６）から始めましたが、染まりませんでした。別のラット由来抗体(CD31)では同じプロトコールで染色されるので、使用中の各試薬類のが原因とは考えづらいです。一体何が問題で染色されないのか分からなくなっています。

(無題) 削除/引用 No.1188-2 - 2011/11/09 (水) 08:05:14 - 組織 うちもSerotecのF4/80を使ってますが、パラフィンでも凍結切片でもきれいに染まるのですごく使いやすい抗体という印象ですけどね。マクロファージなら正常組織を含めてどの組織にもたくさんいるので、ポジコンをおかなくても大丈夫なくらいです。 ラボで免疫組織化学はいつもされてるのでしょうか？もし差し支えなければ、脱パラフィンから検出までの全てのプロトコールを教えていただければ、具体的なアドバイスができるかもしれません。

マクロファージ免疫染色 削除/引用 No.1188-1 - 2011/11/08 (火) 22:26:47 - P 現在糖尿病マウス腎臓を用いてマクロファージ免疫染色を行っていますが、全く染色されません。 抗体はよく用いられているF4/80（AbDserotec MCA497）です。同じクローンの別のメーカーの抗体も試したもののうまくいきませんでした。 染色プロトコールはAbDserotecのマニュアル通りにしており、抗原賦活化は10mMクエン酸バッファーで95℃x10min、一次抗体は50:1でO/Nしております。 ポジコンの肝臓や脾臓での染色は確認していますが、それでも染色が少し弱いような感じです。 4%パラホルム固定パラフィン切片、新鮮凍結切片とも試してみたものの同様の結果でした。 他の論文で同じ週齢のマウスの腎組織を用いてF4/80染色をした報告は多々あるため、マクロファージ浸潤自体がnegativeとは考え難いのですが。 何か助言いただければ幸いです。よろしくお願い申し上げます。

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