全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1187-12 - 2011/11/15 (火) 22:50:39 - ab >[Re:9] KYさんは書きました : > おそらく結局どちらもProtein A/Gを介して抗体に結合するので、その量に大きな違いがない限りは、目的のタンパク質の回収量に大きな差はあるとは思えません。 結構違いますよ。 製品のデータシートにも単位容量辺りの最大結合量が載っているので比べてみるとよくわかります。原因は、多孔質か表面だけの吸着かです。 >[Re:8] TKさんは書きました : > ある磁気ビーズを販売している会社では、「セファロースだと多孔性のため内部に抗体が結合してしまうが磁気ビーズは表面に結合するため回収率が高い」とアピールしているのですが、アフィニティークロマトグラフィーの本の坦体の選び方の項には「タンパク質分子が自由に内部の結合リガンドに入っていけるように十分大きな孔のある多孔質で、カラムの結合容量を大量に増加できること」と書いてありました。 用途によると思います。磁気ビーズの場合は細胞の回収にもよく用いられます。 セファロースはビーズの内部にまで抗体が入りますが細胞は中には入れないので、内部に入った抗体の分を無駄にしてしまいます。そのため、表面にしか結合しない磁気ビーズの方が最大限に結合した抗体を利用できると考えられます。 クロマトグラフィーや免疫沈降に用いる場合でも、磁気ビーズの方が結合容量が多いというのは疑問です。 > 担体を選ぶ際に重要なことはなんですか？ この辺は好みもあると思います。個人的には、バッチ法なら磁気ビーズが簡単なので用いますし、大量にタンパク質を精製する必要があるならカラムを用います。 抗体の親和性が弱い場合は、一日くらい循環しておくと改善されます（ポンプ必須）。

(無題) 削除/引用 No.1187-11 - 2011/11/15 (火) 21:14:46 - kt TK様、ab様、Kanata様が書いてあるような読み方でいいんじゃないでしょうか。「バッチ法」では、磁気ビーズの方が溶液とビーズにしっかり分かれるので、ビーズに結合したタンパクの溶出時の回収率が高い。と言うアピールだと思います。カラムでは、フロースルーをもう一回か二回、アプライすることによって、抗体と抗原が反応する機会を増やす事が出来ると思います。時間がかかりそうですが。

(無題) 削除/引用 No.1187-10 - 2011/11/15 (火) 17:24:17 - qq >「セファロースだと多孔性のため内部に抗体が結合してしまうが磁気ビーズは表面に結合するため回収率が高い」 「セファロース・・・・が磁気ビーズは表面に結合する」のは、その通りでしょう。 その後の「ため回収率が高い」の回収率が何を指しているのか、はっきりしません。こんな時は、メーカーの人に徹底的に食い下がるのが宜しいです。 表面吸着の担体で一般的な事は、吸着スピードがゲル内拡散速度に依存しない（というか、ゲル内に拡散しない）ことですから、そこをどう言ってあなたの気持ちを引こうかと考えているはずですよね。 多孔性ゲルのメーカーとて、変わりはありません。

(無題) 削除/引用 No.1187-9 - 2011/11/15 (火) 16:51:50 - KY 聞いた話では、 磁気ビーズはのメリットはノンスペが少なくなる。デメリットは少し値段が高い。 セファソースは磁気ビーズよりかは安い。磁気ビーズよりかノンスペがあるらしい。 おそらく結局どちらもProtein A/Gを介して抗体に結合するので、その量に大きな違いがない限りは、目的のタンパク質の回収量に大きな差はあるとは思えません。 お金が潤沢にあるのであれば、磁気ビーズを大量利用して精製する。 お金を節約することが必要であれば、抗体カラムを使いまわして、たくさんのライセーとを通して精製する。 また目的タンパクの高発現細胞を使用する。 ことではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1187-8 - 2011/11/15 (火) 14:33:23 - TK 返信遅くなって申し訳ないです。 大変参考になりました。ありがとうございます。 しかし、まだわからない事がたくさんあります。 ある磁気ビーズを販売している会社では、「セファロースだと多孔性のため内部に抗体が結合してしまうが磁気ビーズは表面に結合するため回収率が高い」とアピールしているのですが、アフィニティークロマトグラフィーの本の坦体の選び方の項には「タンパク質分子が自由に内部の結合リガンドに入っていけるように十分大きな孔のある多孔質で、カラムの結合容量を大量に増加できること」と書いてありました。 この場合、前者はバッチ法と比較していて、後者はアフィニティークロマトグラフィーに限定して書いてあるのでしょうか？？ 担体を選ぶ際に重要なことはなんですか？ 質問してばかりですいません。 もうここの皆さんの力を借りるしかありません。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1187-7 - 2011/11/13 (日) 06:10:32 - Kanata abさんのおっしゃる通り、アガロースを使った方が結合量は多いのですが、磁気ビーズの方がロスが少ないです。 抗体カラムとバッチ法で回収率の比較をしましたが、バッチ法だと抗体と抗原が反応する機会が増えるので、そちらの方が回収率が高かったです。 スタート地点での蛋白質の量がどれぐらいか、予想される蛋白質の量がどれぐらいかによって方法を決めればいいのでは、と思いました。

(無題) 削除/引用 No.1187-6 - 2011/11/12 (土) 02:58:42 - k カラムにして、アプライするサンプルを増やしたり、何回か繰り返しアプライしてやれば、収量は増えるんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1187-5 - 2011/11/12 (土) 02:47:40 - ab 基本的に、磁気ビーズよりもアガロースやセファロースビーズの方が表面積が稼げるので、単位容量あたりの結合量は1桁以上違います。 アガロースビーズだとバッチ法でロスしやすいですが、カラムが使えるなら回収量としてはよいはずです。ただ、溶出量によっては希釈されるので、濃縮が必要になるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1187-4 - 2011/11/11 (金) 21:02:13 - KY 大量に目的タンパク質が必要であれば、目的タンパク質の過剰発現などにより発現量を上げることが必要に思います。

(無題) 削除/引用 No.1187-3 - 2011/11/11 (金) 13:56:37 - TK 磁気ビーズに抗体を固定化させてからその抗体に特異的に結合する目的タンパク質を結合させます。 要するに免疫沈降です。 精製するタンパク質の量増やしたいのですが、バッチ法では回収できた量が少量で次の実験がうまくいきませんでした。 しかし、磁気ビーズ法でも夾雑タンパク質の除去やサンプルロスはなくなると思いますが、タンパク質の回収量はバッチ法とそれほど変わらないと思います。 なんでもいいんで助言やアドバイスをいただけると助かります。

(無題) 削除/引用 No.1187-2 - 2011/11/09 (水) 18:58:58 - KY 一つわからないのですが、その磁気ビーズはどのように目的タンパク質に結合するのでしょうか？

磁気ビーズ法と抗体カラム 削除/引用 No.1187-1 - 2011/11/08 (火) 13:59:44 - TK 磁気ビーズを使ったタンパク質精製と、抗体カラムを使ったタンパク質精製ではどちらの方がタンパク質の回収量が高いですか？？

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---