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皆様ありがとうございます。 削除/引用 No.1181-6 - 2011/11/08 (火) 13:47:39 - しろねずみ バックグランド様 ありがとうございます。バックグラウンドが低いというのは、FACSの場合はisotype controlが十分低いことと考えてよいでしょうか？抗体によって、isotypeとsampleがはっきり分かれるものと少ししか違わないものがあり、そのあたりが微妙かもしれません…。 Harmonia様 ありがとうございます。私はウエスタンではリン酸化、非リン酸化蛋白をそれぞれ検出する抗体で染めていましたが、リン酸化で電気泳動の泳動度が変わるということを示すほうが有用な方法のでしょうか？ほぼ素人状態で申し訳ありません。 yyy様 ありがとうございます。確かに、どの程度の特異度なのかというのは重要な問題ですね…。ただし、私が細胞を刺激してタイムコースでリン酸化をみた際、同じ細胞でも抗体の種類によりピークは異なるので、まったく同じものが染まっている訳ではないようでした。（すみません、答えになっていませんが。） お粗末君様 色々アドバイスありがとうございます。そのとおりです、私はECLを用いて実験していましたが、やはりそうでしたか。ちなみにサンプルバッファーに蛋白を入れて、94度で10分くらい加熱して使用していました。可溶化法は検討の余地がありそうです。

(無題) 削除/引用 No.1181-5 - 2011/11/07 (月) 10:24:00 - お粗末君 再現性が乏しいとのことなので考えられるのはECLを用いて検出していませんか？ECLでわずかな定量を行なうのは難しいです。蛍光抗体などを用いているのであれば、サンプル調製に問題があるかもしれません。もし、特定のタンパク質のリン酸化を検出する抗体を用いているのであれば、可溶化法を検討してみたらいかがでしょうか。可溶化しやすいタンパク質であればSDSサンプルバッファーでの加熱の有無で結果が変わるかもしれません。通常のSDS-PAGEでは必ずしもリン酸化の変化で移動度が検出できるとは限りませんので、phos-tagを用いてみるのも手かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1181-4 - 2011/11/07 (月) 08:21:21 - yyy 自分でリン酸化検出の実験はやったことは無いので素人意見ですが、抗リン酸化（標的タンパク）抗体の特異性はどの程度なのでしょうか？ Cytometoryで見てると言うのは、刺激による他のタンパクのリン酸化も一緒に検出してる可能性はありませんか？

(無題) 削除/引用 No.1181-3 - 2011/11/07 (月) 08:08:02 - Harmonia ウエスタンとフローサイトの情報は、情報の質が同じならどちらか一方でいいと思います。 ただ、僕がレフリーなら、 「リン酸化の変化で電気泳動の移動度が変わるはずだから見せろ」 くらいのことを要求するかも。 （感覚的な表現をします） 抑制系は、苦労しますよね。 100が90になるのと、0が10になるのでは、おなじ10の変化でも、後者の方が変化があるように見えます。検出系を変えると、うまく表現できるかも。

(無題) 削除/引用 No.1181-2 - 2011/11/06 (日) 19:39:28 - バックグランド IF(免疫染色）でも同じなんですが、ウエスタンは蛋白分子を分けてそれぞれを見ているので信用性が高いです。一方、Flow Cytometryではバックグランドを含め「すべての蛋白分子の合計のシグナル」を見ているので、バックグランドは十分低くなければいけません。 よって、いろいろなコントロールでバックグランドが低くない場合、ダメでしょう。ただ、書き方にもよるかもしれません。

リン酸化をWesternではなくFlowCytometryでみる 削除/引用 No.1181-1 - 2011/11/06 (日) 12:19:00 - ももも いつも参考にさせていただいています。 ある細胞を刺激してシグナル経路のリン酸化が、化合物で抑制されるかをウエスタンブロットでみていましたが、 刺激によってもリン酸化が1.5倍程度にしか増えず（色々条件はふって検討してみましたが）、抑制される度合いがやや弱いため、再現性と定量性が得にくく苦慮していました。 そこで、フローサイトメトリーでリン酸化蛋白を細胞内染色してみたところ、きれいな結果が得られ、再現が取れるようになりました。 このような場合、論文投稿時にウエスタンの結果は出さずに、フローサイトのシグナルのデータだけで出してもよいものでしょうか？ 最近の論文では、フローサイトのみのシグナルのデータが出ている論文も見受けますが、多くはウエスタンのデータと両方のせていることが多い印象ですが… やはり現在でもリン酸化はウエスタンでみるのが一般的でしょうか？ 上司が困ったことにあまり詳しくないため、こちらでご相談させていただけないかと思い書き込ませていただきました。

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