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(無題) 削除/引用 No.1167-3 - 2011/11/02 (水) 14:47:38 - toyo APさんのレスにありますように、化学発光の場合はタンパク量が多いとバンドが白抜けすることがあります。 何度か経験したことがありますが、このような場合はバンドの中央が白く抜けて、バンドの辺縁部が濃く見えるので、判別がつきます。 むしろ、メンブレンへp53よりも強く吸着するような、移動度の類似したタンパク質が存在する可能性は考えられないでしょうか? タンパク質のメンブレンへの吸着量には上限があるので、条件によっては他のタンパク質との競合が生じます。 つまりサンプル量を振った場合、あるサンプル量より上では競合タンパク質の方が優勢になってしまって、標的タンパク質の吸着量は徐々に減っていく可能性があります。 核画分を精製しているとのことですので、可能性は低いかもしれませんが。 実験の進行上は、10-30ugの範囲で系を動かせばよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1167-2 - 2011/11/02 (水) 12:58:03 - AP 量とシグナルのリニアリティーの範囲やダイナミックレンジは、多分に検出方法によります。 酵素標識・化学発光・フィルム検出なんかだと、その範囲はあまり広くはないですね。 感度はともかくレンジの広さで言えば、フィルムよりか性能の良い取り込み装置、酵素標識法より直接標識法、化学発光よりRIや蛍光のほうがいいでしょうね。 酵素量とシグナル強度が常に正比例であるなんてありえないし、ましてや完全な液体中の反応ではなく酵素が膜に固定されて自由に分子運動できない状態では、基質と出会う確率も位置によって違うだろうし（スポットの周辺部と中心部、膜の表面部と深部など）。また、標的タンパク質も、量が増えていっても、それに比例して膜につくのか、各エピトープが抗体とであう確率は一定なのか、というとそうでもないでしょう。 ちなみに、パーオキシダーゼ/ルミノール系の検出では、シグナルが強すぎると、バンドが中抜けする（白く飛ぶ）ことがあるというのは、過去トピでなんども話題に上がっています。60 ug以上でかえってバンドが薄くなるというのはこれじゃないでしょうか。

アプライする蛋白量とバンドの出かたについて 削除/引用 No.1167-1 - 2011/11/02 (水) 09:05:05 - TakayamaG 現在、MEFにおけるp53の発現をウエスタンブロッティングで評価しようと試みています。 元々、MEFでの発現は弱いため、核蛋白を抽出してウエスタンを行おうとしています。 予備実験として、10ug, 20ug, 30ug, 40ug, 50ug, 60ug, 70ug, 80ugの核蛋白をアプライしてSantaCruz p53(C-19)にてバンドの評価を行いました。（アプライする蛋白量を決める為に）10-30ugの範囲では蛋白量に応じてバンドが濃くなるのですが、40-50でプラトーとなり、60ug以上では逆にバンドが薄くなるという結果となりました。始めは、53Kda付近の分離不良を考え、泳動バッファをMESからMOPSに替え、泳動時間を延ばしましたが、結果は同じでした。アプライする蛋白量が多すぎると、この様にバンドの出かたが影響を受けるものなのでしょうか？ご教示の程、宜しくお願いします。

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