全26件 ( 21 〜 26 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.1149-6 - 2011/10/29 (土) 14:06:36 - page 完璧に泳動をしたいマニアの間で昔から良く知られてる話ですが、日本エイド−のDNA-PAGE用電気泳動装置という装置でSDSPAGEすると、コームの両端までスマイリングが出ず、フラットになります。なぜかは謎です。理由は電極の位置にありますと、メーカーの人は言うのですが、普通に見えます。メーカーに頼めば貸してもらえるんじゃないですかね。コームも希望するのを言えば、カタログにあるのと同じ値段で作ってくれます。もちろん、塩濃度やタンパク量が過剰だと、そのレーンの泳動が異常になるのは当然ですが、スマイリングだけは起こりません。

(無題) 削除/引用 No.1149-5 - 2011/10/29 (土) 12:07:03 - D >先輩からは > >・全てのレーンに同量のタンパクを流す。空きレーンは作らず、マーカーレーンにもBSAを足してタンパク量を等しくしておく。 >・ボリュームも全レーンで等しくする（マーカーレーンだけ20ul、他は30ul等とはしない） >・低電流で時間をかけて流す > >など教えて貰って試したのですが、まだ完全とはいきません。 空きレーンと、マーカーレーンのボリューム調整には、何を使っているでしょうか？ サンプル調整時に使った時と同じ、 Lysis Buffer (+各種インヒビター) +Sample Buffer の組成でしょうか？ （ここで、Lysis BufferではなくH2Oを使っていると、上手くいきませんが・・・。） また、マーカーレーンで足すBufferの容量は、 使っているマーカーに含まれるBufferの種類と、上記Bufferの組成によっては 加えるBufferの量を考える必要が出てくる場合もあります。 （まあ、大抵は全レーンで同じになるようにすればいいですが。） あと、私はマーカーレーンにＢＳＡなどのタンパクは足したことがないです。

(無題) 削除/引用 No.1149-4 - 2011/10/29 (土) 09:53:53 - qq ＞サンプルバッファーを全てのウェルに入れるのは 途中で終わってましたね。 サンプルバッファーを全てのウェルに入れるのは有効だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1149-3 - 2011/10/29 (土) 09:33:18 - qq 先輩の意見は、まあ、その通りだと思います。 みんな忙しいので、泳動電流を高めに設定していると思います。1mm x 10cmのゲル断面で、40mAで泳動しているのであれば、20mAに落とすのは有効かもしれません。泳動時間が長すぎると、バッファー漏れで泳動停止が起こり得ます。 マーカーにBSAを足すのはビックリ^2しました。いくつかのペプチド抗体は、BSA抗体を含んでいる場合がありますから、問題が発生するかもしれません。サンプルバッファーを全てのウェルに入れるのは あなたの目的であれば、ポンソー染色して、バンドを見ながら膜を切断して、その後でポンソーを弱アルカリで脱色する方法が有効かもしれません。 ポンソー染色は、比較的ウェスタン検出に問題なく使えますが、どの抗体でもOKとは断言できないので、何らかの確認が必要です。 スマイリングは、ゲルの端が、ゲル内部と異なる通電状況になることが原因（だから、サブマリンのDNA電気泳動では殆どスマイリングしない）ですから、幅の広いゲルを使って泳動して、スマイリングしそうな両端を切り捨ててしまえば良いかもしれません。ゲル側面からの漏電も重要そうなので、ゲルのスペーサだけをシリコナイズするのは、アイデアとしてはアリかもしれません。ゲル板全体のシリコナイズをしてはいけないと、大昔、誰かに聞きました。 そんな努力をするよりも、もう一枚電気泳動する方が早いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1149-2 - 2011/10/29 (土) 07:08:32 - 220V InvitrogenのPremade（Nupage?)を使っていますが、とくに問題ありません。１５レーンを愛用していて両側１レーンづつだけ使えないくらいです。220Vくらいで流しています。

SDS PAGEでスマイリングを防ぐ方法は？ 削除/引用 No.1149-1 - 2011/10/29 (土) 06:14:41 - 犬が西向けば尾は東 よろしくお願いします。 ウェスタンブロッティングにおいて、スマイリングを防ぐコツを教えて頂けますでしょうか？ 複数ある目的タンパクのサイズの違いを利用して、一枚のメンブレンを数枚に切り分けてそれぞれに別の抗体を使うことで、メンブレンを何枚も作る（あるいはストリッピングする）手間を省きたいと思っております。ゲルにapplyするcell lysateを節約する狙いもあります。 アガロースゲルにDNAやRNAを泳動した時のように上から下まで真っ直ぐに泳動できれば、切り分けが容易になると思っているのですが、なかなかうまくいきません。どうしても、スマイリング（10レーンある既製の4-20%ゲルで泳動していますが、中央に近いレーンの進みが少し早い）してしまいます。 先輩からは ・全てのレーンに同量のタンパクを流す。空きレーンは作らず、マーカーレーンにもBSAを足してタンパク量を等しくしておく。 ・ボリュームも全レーンで等しくする（マーカーレーンだけ20ul、他は30ul等とはしない） ・低電流で時間をかけて流す など教えて貰って試したのですが、まだ完全とはいきません。 どなたか、こうすると真っ直ぐ流れるよ、というようなコツをご存じの方、教えて頂けたら幸いです。よろしくお願いします。

全26件 ( 21 〜 26 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---