全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1141-7 - 2011/10/29 (土) 19:38:26 - モモ インサートをどうやって作ったのか、ベクターをどのように準備したのか、エンドはどうなっているのか、まずはそのあたりから確認しましょうか？

(無題) 削除/引用 No.1141-6 - 2011/10/28 (金) 15:55:40 - アポーン ＵＶの影響を受けてるかもしれません…。 今まではＵＶにさらした状態で、バントを切断してgel extractを してました。 UVをあてずに試してみます！

(無題) 削除/引用 No.1141-5 - 2011/10/28 (金) 15:29:54 - AP インサート（ベクターも？）ゲルから切りだしてるんですよね。 すっかりなんにもコロニーが出ないとか、出ても異常に少ないとかいうような場合、 UV被爆に対して配慮していないなら（実際どうやっているのでしょう）、それが原因の可能性大です。 一分子の中に一箇所でもピリミジンダイマーがあると、複製が止まってしまいます。DNAが長いほど的が大きくなるので、同じUV照射条件でも、一分子のどこかにピリミジンダイマーをもつDNA分子のできる確率が上がって、影響が大きくなるようです。

(無題) 削除/引用 No.1141-4 - 2011/10/28 (金) 15:01:19 - 7744 > エレポが上手くいってないのか、 そう思うのであればエレポせずに播種するサンプル、ベクター無しでエレポだけして播種するサンプルを用意してみてもいいのでは？？？ 前者だけでコロニーができればエレポの問題だし、両方でできなければそれ以前の問題だし。

(無題) 削除/引用 No.1141-3 - 2011/10/28 (金) 14:54:59 - アポーン 前回、別のインサート(3Kb)を4KbのベクターにLigationして、 その時はコロニーが十分に生えてきたので、コンピテントセルの タイターとLigaseに問題がないことは確認できたと思います。 今回はインサートとベクターのサイズが前回より大きいので、 それによる影響を受けているのかもしれません。 UVの照射、PEG、Ligationの時間をO/Nにする所は気をつけようかと 思います。前回のLigationの時間は5hでした。 モル比の検討はまだしていませんでした。 助言、ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.1141-2 - 2011/10/28 (金) 12:07:19 - ~ 問題が無いことが分かっている部分はどこなのでしょうか？ 他の実験でエレクトロポレーションのタイターを見たり、ligaseが生きていることは確認できているのでしょうか？ 既に試されているかもしれませんが、モル比の変更以外の対応として、 ・ベクター、インサート共に、UVを全くあてずに切り出してはいかがでしょうか。 UVでDNAがダメージを受けていることが原因かもしれません。 ・LigationのバッファーにPEGが入っているのであれば、PEGの無いバッファーで反応させて見てはいかがでしょうか。 インサートが長い場合はPEGが逆に悪さをするといっている人がいます。 ・O/Nでライゲーションしてみてはいかがでしょうか。 理由は分かりませんが、長めに反応させると取れることがあります。 などがあります。

Ligationが上手くいかない？ 削除/引用 No.1141-1 - 2011/10/28 (金) 11:08:09 - アポーン 質問があります。 7Kbのインサートを、12KbのベクターにLigationして Transformationをしているのですが、全くコロニーが生えません。 インサート : ベクターのモル比を3:１でLigationしており、 ベクターのDNA量は100ngほど入れてますが、何度やっても全くコロニーが生えません。 Transformationはエレポを使ってます。 どこを改善すれば良いか困ってます。 ちなみにベクターはAP処理して、セルフライゲーションを抑えてまして、 このベクター単独では全くコロニーが生えません。 エレポが上手くいってないのか、Ligationのモル比が悪いのか よく分かりません。 もし、助言を頂ける様でしたら、お願いします。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---