WB初心者です。適切な説明ができないかもしれません。ご容赦下さい。
現在、ある刺激によってある蛋白Aのリン酸化をみる実験をしております。
その蛋白の分子量は140kDで、total A、phospho A(Ser○○)はちょうど目的の分子量のところに
バンドが出ており、非特異的バンドも少なく、正しいと思います。結果もreasonableです。
分子量マーカーはGEのレインボーマーカーを使用しており、150kD(赤)の下にbandが出ます。
一方、このメンブレンに、先日購入したphospho A (Thr○○)の抗体をつけると、
まだ条件がうまく決めれていないためか(Santa-Cruz製品で1:200からスタートと記載あり)
低分子量の非特異的バンドも多く、見にくいのですが、
150kDのマーカーのわずかに上にバンドが出ます。
このバンドの周りには非特異的バンドがほぼ無いので、このバンドは割とくっきり見え、
もしこれがtrue bandなら、結果としてはreasonableです。
しかし、分子量がやや違うところにバンドがあるため、これがtrue bandか確証が得られません。
140kDあたりにも、わずかにバンドがあるようにも見えなくも無いのですが、
相当薄いので、これが見えるように条件を変えると、おそらく非特異的バンドが更に増えて、
真っ黒なメンブレンになってしまいそうに思います。
このphospho A (Thr○○)のバンドとして、この150kDの若干上に出たバンドを
true bandと考えることはできるのでしょうか?
購入可能な抗体はSC以外だと、CSTのものしか無く、
こちらは反応種でHumanは( )付きのため、ヒト正常細胞を使うものとしては
あまり期待できず、SC製品を買った経緯があります(参考文献あり)
諸先輩方、何卒ご教示宜しくお願い申し上げます。 |
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