BioTechnicalフォーラム [マウスから肝星細胞の単離]

マウスから肝星細胞の単離

No.1130-TOPIC - 2011/10/26 (水) 18:29:06 - KC

肝臓の線維化に関わる研究を行っております。
in vivoでの実験で良い結果が得られているため、
ex vivoでそのメカニズムを解析を行おうと思い、
マウス肝星細胞の単離を試みております。

文献的には門脈経由でコラゲナーゼ還流をして、細胞をバラバラにして
ナイコデンツによる比重分離をするようになっております。

実際にはマウスの門脈がかなり細く、27G程度の注射針ではなかなか
カニュレーション困難で難渋しております。
肝臓に還流液が流れれば理論上問題ないと考え、横隔膜上で下大静脈を
結紮して、肝静脈より下から下大静脈にカニュレーションを試み、
門脈を切開して血液を追い出すことを試みております。

実際に単離を行っている方などいらっしゃれば、
どのような経路で環流するのが手技的に安定してできるのか？
また、実際使用されている注射針などの情報があれば、
宜しくお願いいたします。
　

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Re: コメントありがとうございます 3

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No.1130-7 - 2011/10/28 (金) 10:31:00 - KC

SPEさん、早速のお返事ありがとうございました。

みなさんがいろいろと試行錯誤で苦労して得られたコツを
お教えくださることに大変感謝しております。

(無題)

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No.1130-6 - 2011/10/28 (金) 10:19:24 - SPE

使うマウスは遺伝子改変モデルに応じて様々です。BL6に戻しているものもあればmixedの時もあります。個人的にBL6のPVが太いことが多い（刺しやすい）と思うのですが、単に気のせいかもしれません。

24Gが一番細いと思っていたのですが、改めて探してみると26Gのカテもあるようです。

5-6週齢より若いマウスに刺したことはないのですが、このくらいの週齢でもPVに24Gは入ります。

Re: コメントありがとうございます２

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No.1130-5 - 2011/10/28 (金) 09:38:08 - KC

SPEさん、コメントありがとうございました。

穿刺後はカテーテル針の方が固定が安定すると思っていましたが、
24Gでも門脈に入るんですね。
ヒトにおける駆血帯と同じようにうっ血させるアイディアはさっそく試そうと思います。

ところで、マウスのstrainや週齢は意識して選ばれていらっしゃいますでしょうか？
当方はC57bl/6 8週齢を使用しております。

(無題)

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No.1130-4 - 2011/10/27 (木) 23:01:03 - SPE

当方は24Gのカテーテル(BD #381112)を使っています。門脈の太さはマウスによってかなり違いますよね。私はPVの穿刺に失敗したらIVCに切り替えています。

門脈が細いときは肝臓に近い部分をバスキュラークリップでつまむと門脈が太くなって刺しやすいです。穿刺後にクリップを解除し、外套を押し進めて内筒を抜きます。解除したクリップはカテーテルと周囲組織をまとめてつまんでおくとカテーテルを保持できます。空気の混入を避けるために、カテーテルから血液のbackflowがポタリとたれるまで待ってからチューブを接続しています。

Re: コメント有難うございます

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No.1130-3 - 2011/10/27 (木) 21:03:01 - KC

Belsize+Parkさん、コメント有難うございます。

さっそくSTOMACHERなどの細胞分離機？などもサーチさせていただきます。
還流で採取するのであれば、手技的に慣れるしかないのですね。
マウス門脈の細さに心折れそうですが、いずれかの方法で頑張ってみます。
取り立ててお礼のみで。

(無題)

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No.1130-2 - 2011/10/27 (木) 20:28:16 - Belsize+Park

肝星細胞で実験を行っています。
私も当初は還流を使って、細胞を獲ておりましたが、手技がやや瀕雑なため現在は、取り出した肝臓をコラゲナーゼを含む還流液の中で、STOMACHERという機械で機械的にホモジナイズし、さらにその溶液中でインキュベートしたあと、オプティプレップで密度勾配遠心をして、細胞を得ております。還流に比べると、得られる細胞数と、接着率がやや弱いのが難点ですが、抽出直後の生細胞率は95%程度です。細胞数が還流に比べると少ないので、実験によっては4ひきのマウスをプールして使っております。他の会社からも似たような機械がでております。肝細胞はメカニカルなストレスに弱いのでこの方法では細胞は得られません。

還流にこだわるのであれば、マウスで、門脈からの還流、27Gで問題ありませんでした。下大静脈
からの還流であれば、手技的にはもっと簡単かと思われます。肝細胞に限っていえば、門脈からの還流の方が、いいという話を聞きますが、星細胞に関してはわかりません。
還流手技は慣れるしかないとしかいいようにありません。YOUTUBEやどこかのサイトに肝細胞の単離の仕方の手技がビデオででていますので、参考になるかと思います。

マウスから肝星細胞の単離

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No.1130-1 - 2011/10/26 (水) 18:29:06 - KC

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