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SDSPAGEとサンプル中のバッファーの相性 トピック削除
No.113-TOPIC - 2011/03/05 (土) 03:01:52 - おお
分離ゲルpH8.8トリス、スッタッキングゲルpH6。8のクラッシックなSDSPAGEをしています。PBS+1%TRITON X100で電気えいどうしたところ若干バンドがシャープでない(TBSベースより)ような事がありました。

たまたまかもしれませんが(というのもそんなに今まで違いがあったかなぁという感想もあるので)、そういえばライシスバッファーはトリス、ヘペスベースがおおいなあという気がしています。

サンプル中のバッファーとSDSPAGEとの相性についてなにか感触、知識があれば教えてください。違うバッファーを使ったSDSPAGEのシステムについてデモかまいません(どんなけいのSDSPAGEでどのバッファーが相性悪いとかいていただければ)。
　
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No.113-6 - 2011/03/07 (月) 08:52:20 - おお
>[Re:5] APさんは書きました :

ありがとうございました。やはりネガティブにチャージしているものは場合によっては影響するかもと思っておいた方がいいかもしれませんね。ライシスバッファーにTRISを使っているのが殆どで燐酸バッファーをあまり見かけないのはそういうのがあるのかなぁとちょっと勘繰ったりしていました。でもよく分からないですけどね。

HEPESもよく使われるけどそれで変だったという印象はないし、pKや電荷の数も影響するはずですね。

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No.113-5 - 2011/03/05 (土) 19:34:30 - AP
こんなストーリーを考えてみました。

サンプルバッファー、濃縮ゲルのTris-Cl bufferでは陰イオンがCl-。解離度が高いので100%イオン化していて、いっせいに陽極に移動する。泳動バッファーからゲルに流入してくる陰イオンはグリシンで、サンプルバッファー・濃縮ゲルの弱酸性条件(pH6.8)では電離が制限されてゆっくり移動し、濃縮ゲルと分離ゲルの境界でCl-のエッジに追いつき、pHがアルカリ性（pH 8.8)になるまで自由に移動できない。Cl-のエッジとグリシンのフロントラインとの間で、SDS化されたタンパク質が濃縮される。

このとき、サンプルバッファーに電離度が中庸の陰イオンであるリン酸基があると、グリシンのフロントラインと、Cl-のエッジのあいだに挟まって、両者がぴったり近接するのを妨げるので、サンプルタンパク質がシャープに濃縮されない。

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No.113-4 - 2011/03/05 (土) 12:53:48 - おお
同じ界面活性剤でバッファーの組成だけを変えていますので、バッファーの問題かもしれないとおもってます。カリウムもどうしても使わないといけないことがあるので存在すれば問題があることも存じ上げてます。
今回はPBSですし、量としてそんな問題があるとは思わなかったです。くわえて、だれか昔特殊な実験をしていてあまり普段使わないバッファーを使った時きれいにいかず、バッファー置換を考えたという話を聞いたことがあります。

そんな経緯で質問を立ち挙げました。TRITON-X100ですが、流れかたは比較的良好です。問題があるという指摘ならもう少し工夫するともっときれいになる可能性はありますね。でもTRITONーX100またはNPー40 1%は標準的なプロトコールです。

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No.113-3 - 2011/03/05 (土) 09:31:49 - qq
問題点は、Tritonの濃度（SDSよりも十分に低い）、カリウム濃度（SDSの析出が起こらない程度に低い）、塩濃度（泳動の電流に影響しない程度に低い）ことだと思います。
２Xサンプルバッファーであるとすると、SDSは終濃度で1-2%でしょうから、Triton-X100の終濃度（0.5%）が高いかもしれません。サンプルバッファーが２xでなく、５xだったりすると、Triton-X100の終濃度（0.8%）はSDSに比べてかなり高いような気がします。
それ以外に、PBSがダルベッコのPBSであれば、カリウム濃度はあまり問題になりませんし、塩濃度としても、差して問題であるとは思えません。

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No.113-2 - 2011/03/05 (土) 09:27:25 - 大変驚いています
１％NP40とNupageは相性が悪いようで、バンドが点のようになってしまうことを最近経験しました。TCAやアセトンなどでNP40を多少除くと正常に流れました。

SDSPAGEとサンプル中のバッファーの相性 削除/引用
No.113-1 - 2011/03/05 (土) 03:01:52 - おお
分離ゲルpH8.8トリス、スッタッキングゲルpH6。8のクラッシックなSDSPAGEをしています。PBS+1%TRITON X100で電気えいどうしたところ若干バンドがシャープでない(TBSベースより)ような事がありました。

たまたまかもしれませんが(というのもそんなに今まで違いがあったかなぁという感想もあるので)、そういえばライシスバッファーはトリス、ヘペスベースがおおいなあという気がしています。

サンプル中のバッファーとSDSPAGEとの相性についてなにか感触、知識があれば教えてください。違うバッファーを使ったSDSPAGEのシステムについてデモかまいません(どんなけいのSDSPAGEでどのバッファーが相性悪いとかいていただければ)。
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