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(無題) 削除/引用 No.1129-6 - 2011/10/28 (金) 03:04:14 - ab 発現しようとしている遺伝子に大腸菌のレアコドンは含まれていませんか？ その場合は、Rosetta系を使用した方がよいです。 活性測定よりも、SDS-PAGE、可能であればWestern blottingで確認しないと発現の有無はわかりません。

(無題) 削除/引用 No.1129-5 - 2011/10/26 (水) 18:52:23 - ~ 今回は超音波破砕後のクルードな状態で活性試験を行なわれたのでしょうか。 前はSDS-PAGEで発現を見られていましたよね。発現も見てはいかがでしょうか。 リコンビナントタンパク質が活性を持つかは事前には分かりませんので、活性のみを指標に追うのは危険だと思います。 （そもそもクルードな状態での添加回収試験等で、測定系が動いていることは確認されているのでしょうか？） また、長くはまりそうであれば、タグ付きのベクターも作り、検出や濃縮をしやすいもので検討したほうが、結局は近道になるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1129-4 - 2011/10/26 (水) 18:29:07 - もくもくさん SDS-PAGEで予想される場所にバンドは確認できますか？ 活性測定を行なう前にタンパク質溶液のバッファー交換をされていますか？ pColdIはコールドショックで発現誘導されるプロモーターなので、挙げているBL21株のいずれでも使用可能だと思います。 DE3やpLysSはT7プロモーターでの発現誘導/発現抑制に必要です。 発現誘導時間を延ばす（15℃で二晩以上培養）のが、簡単で望みがある方法ではないでしょうか。

わざわざありがとうございます。 削除/引用 No.1129-3 - 2011/10/26 (水) 18:07:57 - ゆずゆ Amp濃度はどれくらいか分からなかったので、一応振りました。 誘導するときのODを検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.1129-2 - 2011/10/26 (水) 18:02:00 - ｔｔｔ 細胞毒性による影響なら増殖曲線が普通のものと結構変わっていると思いますが 増殖曲線はどうなってますか？ Amp濃度を振る意味ってあるんですか？ 自分のラボではまず誘導ＯＤの検討から始める事が多いですね

コンピ変えてもタンパク発現が上手くいかない 削除/引用 No.1129-1 - 2011/10/26 (水) 17:58:49 - ゆずゆ いつもこちらを利用させていただいてます。 大腸菌にタンパク発現させようとしていますが、上手く行きません。 前回、こちらでアドバイスをいただいて、pCold�Tを用いて、組み換えプラスミドの構築までは確認できました。 （プラスミド抽出して、インサート配列をシーケンスで確認しました。） 大腸菌に形質転換させて、タンパク発現させるところでつまっています。 前回は、JM-109株で形質転換させたのですが、発現せず、みなさんのアドバイスからタンパク発現に有利なBL-21株に変えて、形質転換 させましたが、発現しません。 メルクのBL-21株を使って、Amp濃度を50・100μg/mLで振って、OD600=0.5でIPTG 1mMでプロトコル通りに行いました。 活性試験を行ったのですが、活性がありませんでした。 まず、なぜ発現しないのか？ 冷却時間や、Amp濃度、IPTGの有無、IPTGの濃度など振らなければならない箇所は山ほどありますが、みなさんはどこが怪しいと思いま すか？ BL-21株を用いて発現しなかったことがある方のご意見をぜひ伺いたいです。 組み込んだものが腐敗性のポリアミンの遺伝子なので、細胞毒性による影響か何かなのでしょうか？ また、メルクのBL-21株には�@BL-21(DE3) GLYCEROL STOCK BL21（T7 RNA polymeraseを含むλDE3遺伝子）と�ABL-21(DE3) pLysS GLYCEROL BL21（T7 RNA polymeraseを含むλDE3遺伝子、T7 lysozyme遺伝子を含むpACYC184）と�BINDUCTION CONTROL A BL21（T7 RNA polymeraseを含むλDE3遺伝子、T7 lysozyme遺伝子を含むpACYC184 pET-14）とありますが、使い分けや違いなどについて教えてください。 私は今回�@を使用しました。 どうぞよろしくお願いします。

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