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(無題) 削除/引用 No.112-18 - 2011/03/08 (火) 19:17:56 - 大変驚いています 追伸、Sさん ・ 着色済みスタンダードタンパク質のバンドは、iBlotでほぼ完全に転写されますが、色素結合タ ンパク質の多くはゲルから溶出しやすいため、他のタンパク質の完全なトランスファーを示し てはおりません。 ここは読んでおりませんでした。どうやら本家もトラブルに気づいているようです。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.112-17 - 2011/03/08 (火) 18:42:48 - 大変驚いています proteinさん、やはりそうですか（！！！）。着色マーカを１００％信用できないのですね。参考になりました。ありがとうございます。 Sさん、ありがとうございます。具体的に挙げなかったのですが、既述です。＞＞112-5のこれかもしれません（Nupageは高分子量転写の改良方法がウエッブに載っています。）

参考までに・・・ 削除/引用 No.112-16 - 2011/03/08 (火) 11:16:59 - S InvitrogenのHPにトラブルシューティングが出てました。 以下抜粋。 [ トランスファー前にNuPAGE転写バッファーで平衡化を行う。 ] NuPAGEまたはトリス-グリシンゲルからの高分子量タンパク質の溶出を改善するために、100mL のNuPAGE転写バッファーにゲルを浸し、室温で20分間振とうして平衡化の後、iBlotトランスファーします。 <平衡化に用いるバッファー； 2x NuPAGE 転写バッファー/10%メタノール > NuPAGE Transfer Buffer, 20x （NP0006-1） 10mL メタノール 10mL ニューページアンチオキシダント (NP0005) 0.1mL 脱イオン水 79.9mL 総計 100mL 平衡化の後、そのままiBlotトランスファースタックへセットし、ブロッティングを行ってください。 ・ 着色済みスタンダードタンパク質のバンドは、iBlotでほぼ完全に転写されますが、色素結合タ ンパク質の多くはゲルから溶出しやすいため、他のタンパク質の完全なトランスファーを示し てはおりません。 http://www.invitrogen.jp/electro/iBlot_troubleshooting.pdf

(無題) 削除/引用 No.112-15 - 2011/03/08 (火) 11:02:29 - protein 以前モニターで使わせてもらい、タンク式トランスファーと並行で 250 kD以上の大きい細胞質タンパク質の転写効率を比べたことがあります。 私の実験でもマーカーの色素が完全に写っておりましたが、 しかしながら目的のタンパク質をウェスタンで検出してみると タンク式に比べて明らかに量が少ないという結果でした。 なので、私もこのシステムが高分子量に向いているということに関しては疑念を持っています。 少なくともタンク式に比べると安定性は低いかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.112-14 - 2011/03/07 (月) 20:04:45 - 大変驚いています >メーカ推奨の転写緩衝液で平衡化するプロトコールも出していた 112-5のこれかもしれません（Nupageは高分子量転写の改良方法がウエッブに載っています。） ＞Bis-Tris系の転写bufferだったような なるほど、特許をとっていると公開されているのですね。 ＞iBlotってタンパク質の抜けやゲルへの残りが多くないですか？ これって、検証が着色マーカ以外だと難しいと思います。 少なくとも、高分子量（２５０Kd)の着色マーカを含めすべてが目視で１００％移ります。 高分子量（２５０Kd)が５０％くらいしか他の方法だと移らないことが多い（私の場合）ので、信頼していたといういきさつがありますが、個別の体験談としてはこれが現実だったら注意が必要ですね。

(無題) 削除/引用 No.112-13 - 2011/03/07 (月) 13:28:59 - こうじ 通常のトランスファーバッファーで軽く浸透した方が良いと 営業に言われたことがあります。 iBlotってタンパク質の抜けやゲルへの残りが多くないですか？ メンブレンが薄い気も、、、 狙っているサイズの近辺だけうまく転写できれば 良いやっていう用途でしか使えない感がありましたが 他のかたはどのような感触をお持ちでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.112-12 - 2011/03/07 (月) 00:08:55 - 笑い男 > >転写前に転写bufferで平衡化とかしていますか？ > していません。純水で軽くリンスして、しないのが標準だとおもいます。 　メーカ推奨の転写緩衝液で平衡化するプロトコールも出していたと記憶しています。あくまでラボで買ってほしいなーと思って調査したときの情報ですので、使用経験はありません。あしからず。 > 正しいかどうかは知りませんが、リーゾナブルな間隔で、美しく流れます（Dual Colour)。色素の効果は多少あると思います。あくまで、目安であり、多少の泳動度変化は議論しても意味がないと思っています。 　同意いたします。プレステインはあくまで目安ですから。 コスモバイオで扱っているFermentasのタンパク質マーカーはhttp://www.fermentas.com/en/products/all/protein-electrophoresis/prestained-ladders/sm181-pageruler-plus ゲルの違いによる見かけ分子量のズレを出しています。Bis-Trisでのずれ方にはビックリした記憶があります。 iBLOTのシステムについては日本語でも特許が出ていたはずです。 トリスグリシンのbufferでは無いことは覚えていますが、・・・・ Bis-Tris系の転写bufferだったような（不確定情報で申し訳ありません） メーカーの売り文句としてはドライシステムだけど高分子も結構転写できますよーと言っていますが、やっぱり高分子はウェットのタンク式がいいのかなーーーーー？ iBLOTもNuPAGE Bis-Trisも同一メーカなので、メーカーとして情報を持っていないものか気になりますね。タンパク個別の等電点などが影響してくると、メーカーとしてもフォローしきれないのかも知れませんが・・・。

(無題) 削除/引用 No.112-11 - 2011/03/06 (日) 21:51:47 - 大変驚いています みなさん、コメントありがとうございます。 ＞ということは、Bis-Tris Gelsでも、事前にTris-Glycineバッファーに置換すればうまく転写できるのかもしれませんね。 私もそう思います。（No.112-5）　今度、レーンが余ったときに切り取ってやってみます。 ＞なぜかははっきりとはわかりませんが、転写バッファーがどんなものかわかると説明がつくのかもしれません。 これはセミドライ？ではなくドライ？？なので、企業秘密で非公開かと思います。

(無題) 削除/引用 No.112-10 - 2011/03/06 (日) 21:39:35 - AP >>転写前に転写bufferで平衡化とかしていますか？ >していません。純水で軽くリンスして、しないのが標準だとおもいます。 ということは、Bis-Tris Gelsでも、事前にTris-Glycineバッファーに置換すればうまく転写できるのかもしれませんね。なぜかははっきりとはわかりませんが、転写バッファーがどんなものかわかると説明がつくのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.112-9 - 2011/03/06 (日) 21:21:31 - 大変驚いています >ゲルAとゲルBの転写の条件は同じですか？（どちらかのゲルでは時間を延ばしたりしていますか？） 同じです。7分が基準ですが8.7分ほどやっています。 >転写前に転写bufferで平衡化とかしていますか？ していません。純水で軽くリンスして、しないのが標準だとおもいます。 >使われているBioRadのプレステインマーカーは、Tris-Gly系でもBis-Tris系でも正しく泳動されるものですか？ 正しいかどうかは知りませんが、リーゾナブルな間隔で、美しく流れます（Dual Colour)。色素の効果は多少あると思います。あくまで、目安であり、多少の泳動度変化は議論しても意味がないと思っています。 とくに転写効率について、プラスの（良い）効果があるのかもしれません。 確かに標的２者間でも位置関係が多少動きます。これは蛋白本来から由来する ＞ゲルのT/Cが違うかもしれないね。 かなり悩みました。もしかしたらQ/Cですか（笑い）。 ＞目的タンパク質の等電点に極端な特長があったりしますか？ 調べてみました。理論的には、目的A蛋白＝5.0　目的B蛋白＝7.2　です。

(無題) 削除/引用 No.112-8 - 2011/03/06 (日) 20:38:31 - AP 目的タンパク質の等電点に極端な特長があったりしますか？ >転写前に転写bufferで平衡化とかしていますか？ これはちょっと気になるところです。

解決方法は知らないですが 削除/引用 No.112-7 - 2011/03/06 (日) 18:52:10 - 笑い男 　iBLOTの情報ってこのフォーラムに蓄積されていないので、 大変有用な質問であると思います。情報を溜めましょう！ 　ゲルAとゲルBの転写の条件は同じですか？（どちらかのゲルでは時間を延ばしたりしていますか？） 　転写前に転写bufferで平衡化とかしていますか？ 　使われているBioRadのプレステインマーカーは、Tris-Gly系でもBis-Tris系でも正しく泳動されるものですか？ http://pdbu-support.bio-rad.co.jp/answers/2010.html 　私自身は、プレステインマーカー（メーカーに関係なく）は色素の電荷の影響で、ゲル濃度やbufferシステムが変わると分子量がずれるものだという認識をしております。250kDaの色素マーカーは本当に250kDaを反映していますか？

(無題) 削除/引用 No.112-6 - 2011/03/05 (土) 12:56:05 - おお ゲルのT/Cが違うかもしれないね。

(無題) 削除/引用 No.112-5 - 2011/03/05 (土) 09:34:47 - 大変驚いています おおさん、 あまり長く流していないので、せいぜい５−６％（４−１２％）のところです。 いずれにせよ、250ｋDaマーカーがほぼ１００％どちらでも転写されているので、ゲル濃度では説明できないと思います。 やはり、たんぱく質の性質とゲル中のバッファーしかないような気がします。そのうち、良いほうのバッファーで少し振ってから試してみようと思います。 （Nupageは高分子量転写の改良方法がウエッブに載っています。）

(無題) 削除/引用 No.112-4 - 2011/03/05 (土) 02:52:58 - おお Bは4%のゲルの中から膜に転写されますが、Aは分離ゲルに入って4%のところから濃い方に移行しているわけですから、目的のタンパクの位置ゲル濃度はもっと濃いはずです。位置から濃度を見積もってその濃度でウエスタンやれば同様の結果が得られるかもしれません。 マーカーはおそらくタンパク性の物で、トランスファーの目安になりますがタンパクによって挙動がいくぶん違う可能性がありますので当てにできないかもしれません。 ゲルのバッファーも違うのでその相性もあるかもしれませんね。どうしても4%ー12%が使いたいというのであれば、えいどうを早めに止めると(ゲルのうえから2/3のところに色素が来た時とか)トランスファーの効率は上がるかもしれませんという憶測はできます。

(無題) 削除/引用 No.112-3 - 2011/03/04 (金) 23:14:37 - 大変驚いています 1)２５０Kdaのマーカーは目視でほぼ１００％転写されます。これは、BioRadのプレステインで、目視です。 ２）目的蛋白はまったく違う250Kda付近の2種で、両方とも、A)ではウエスタンシグナルが250Kda付近にほとんどなく、B)では250Kda付近に強いウエスタンシグナル（バックグランドも低い）が得られております。 電気泳動は、それぞれ、A)、B)推奨のちがうバッファーで泳動、invitrogenのiBlotはセミドライ？なので、転写に用いた試薬は不明です。

(無題) 削除/引用 No.112-2 - 2011/03/04 (金) 22:59:38 - Actias >目的蛋白がB)を使ってはよく転写されるのに、A)ではほとんど転写されない 何を持って転写されるとかされないとか判断されましたでしょうか？ 転写に用いた試薬は何でしょうか？

iBlotウエスタン、Gelによって転写が起こらない。 削除/引用 No.112-1 - 2011/03/04 (金) 20:28:28 - 大変驚いています iBlot, invitrogenをつかって２５０Kda前後の蛋白を膜に転写しておりますが、２５０Kdaのマーカーは目視でほぼ１００％転写されます。ところが、 A) NP0323BOX NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gels B) EC60585BOX 4% Tris-Glycine Mini Gels 目的蛋白がB)を使ってはよく転写されるのに、A)ではほとんど転写されないことがわかりました。大変驚いています。これはよく起こることでしょうか？体験談をお聞かせください。

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