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マウス脾臓細胞をろ過する際のメッシュについて トピック削除
No.1103-TOPIC - 2011/10/21 (金) 16:57:50 - nana
今度初めて、脾臓からリンパ球を単離したいと思っているのですが、
組織中の細胞浮遊液をろ過する際、メッシュの口径はいくつぐらいがちょうどいいですか？
また、ちらっと、キムワイプを使う方法もあると小耳にはさんだんですが、それについても、何かご存知の方がいれば教えていただきたいです。
　
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No.1103-7 - 2011/10/24 (月) 18:05:16 - 7744
どろっとしたもの、個人的にはそういうものはできたことはありません。
ただ、溶血処理でcollagenのカスの様なものができてくることは私もあります。それが正常の範囲内の出来事なのか異常なのかはわからないですが・・・。
で、後にそのカスがassayや実験機器に問題が出るようならmediumで希釈した物をもう一度セルストレーナーに通しています。

そのカスができる原因を自分なりに考えてみたのですが、やはりはっきりわからないでいます。ただ、red blood cell lysis bufferを加える時にちょろちょろ加えるのではなく、多少勢いよく加え、最初の数回のピペッティング
を少し激し目で細胞をばらばらにするイメージでやるとできてこない気がします。（曖昧すぎてすいません・・・）

思ったのですが、どろっとしているものができてくるとしたらそれはgenomicDNAとしか考えられないのですがどうでしょうか？
細胞を調製する過程で必要以上に細胞にダメージが加わっていませんか？
考えられるのは脾臓をすりつぶす過程で激しすぎるとか。

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No.1103-6 - 2011/10/24 (月) 17:02:48 - soy
遠心して、上清を吸引して、再度バッファーでsuspencionする際に、どろっとした塊が残る気がするのですが。当初は血餅のような赤い感じですが、溶血すると、カスのようなcollagenのようなものに見えます。

(無題) 削除/引用
No.1103-5 - 2011/10/24 (月) 15:18:16 - 7744
soyさん

どの段階でどういう作業を行った時にできるのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1103-4 - 2011/10/23 (日) 13:51:21 - soy
私はBDのセルストレイナー(70μm）を使っています。

便乗質問ですが、脾臓でやるとどろどろした塊やcollagenのカスみたいなのができると思うのですが、皆さんそれはどうしていますか？
Collagenase Dも使っていますが、あまり改善ないような気もします。

(無題) 削除/引用
No.1103-3 - 2011/10/21 (金) 18:15:19 - 7744
研究費をケチりたいならemaさんのおっしゃるようにナイロンメッシュを小さく切ってアルミに包んでオートクレーブすれば問題ないです。
お金がたっぷりあるならセルストレーナーを購入すればいいと思います。


何に｢ちょうどいい｣のまったくかわかりませんが、自分の場合だとセルストレーナーを使っていて、口径は40μmを使っています。
リンパ球は結構小さくて10μmよりも小さいので、大体のメッシュは大丈夫でしょう。

ナイロンメッシュ 削除/引用
No.1103-2 - 2011/10/21 (金) 17:54:56 - ema
私は業者に「ナイロンメッシュ（布屋さん）　200メッシュをお願いします」と注文してます。
キムワイプは、、、ロスが非常に出そうでやった事すら無いです。
昔安くあげるのにナイロンストッキングを洗って切って使った事はあります。

マウス脾臓細胞をろ過する際のメッシュについて 削除/引用
No.1103-1 - 2011/10/21 (金) 16:57:50 - nana
今度初めて、脾臓からリンパ球を単離したいと思っているのですが、
組織中の細胞浮遊液をろ過する際、メッシュの口径はいくつぐらいがちょうどいいですか？
また、ちらっと、キムワイプを使う方法もあると小耳にはさんだんですが、それについても、何かご存知の方がいれば教えていただきたいです。
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