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(無題) 削除/引用 No.1100-10 - 2011/10/23 (日) 22:10:49 - コント モモさん、コメントありがとうございます。 monさん、すばらしい解説をありがとうございます。 細胞膜透過性のクロスリンカーというのは確かに魅力的ですね。ぜひ試してみたいと思います。 といいますか、私のプロトコールのチェック事項の上位に置いておきたいところです。条件の組み合わせは限りないので。 IP-ウエスタンの研究室、個人依存性の再現性のなさは、トップサイエンティストでも悩んでいるところだと思います。 ＞Negative Controlの選択が難しいのが難点です。 これは、単にA-B相互作用は、preimmuneの抗体ではコントロールが取れた上で、さらにコントロールが必要であるということと解釈できますが、A-B相互作用以外にA-C、もしくはD-E相互作用のコントロールの選択があまりに任意すぎてむずかしいということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1100-9 - 2011/10/23 (日) 11:48:13 - mon コントさん、初心者の方を想定して書き込みましたが、違いましたね。失礼しました。 クロスリンカーの使用についてですが、適切に使えば問題ないですよ。 もちろん使わないで証明できればベストですが、Endoだとうまくいかないものもありますので、仕方なくという面もあります。 DSPしか使ったことはありませんが、抽出前に細胞ごと処理します。 これにより、細胞内の局在が異なるタンパク同士なのに抽出後に結合した可能性を排除できます。 具体的には、培地を除去し軽く洗浄した後10% DMSO-PBS溶液で10分処理しました（DMSOが白濁するので室温で）。DSPの濃度は今思い出せません（すいません）。その後TBSで３回洗浄後、Trisベースのタンパク抽出処理を行いました。Trisを使用するのは未反応DSPを中和するためです。 Negative Controlの選択が難しいのが難点です。

(無題) 削除/引用 No.1100-8 - 2011/10/22 (土) 09:18:26 - モモ IPではなくてCo-IPの話ですよね。 私の場合は Co-O/E　Co-IPなら６ウエル O/E（ひとつだけ）vs Endogenous　なら６ｃｍ Endoどうしなら１０ｃｍぐらいを目安にしています。 細胞を増やしても蛋白の抽出の効率は下がりますし、INPUTとIPの比は大して変らない印象がありますが・・・

(無題) 削除/引用 No.1100-7 - 2011/10/21 (金) 21:43:52 - コント monさん、ありがとうございます。 >15cm dishで行なうときもあります。 そうすると、10ｃｍプレート2.25枚くらいですね。 ＞Aに結合するタンパクがB以外に沢山ある場合は、大量のAをIPしないとBが検出できません 私のケースだと思います。 ＞0.1%SDSを加えて抽出し10倍以上に薄めて(抗体との結合を確保して） これはトリッキーですね。驚きました。抗体との反応によりAが濃縮効果をもって免疫沈降しないといけないということですね。ただBが0.1%SDSに耐えられるかどうかはやってみないとわかりませんね。 ＞(1)抽出効率等の検討:全タンパク・抽出液中の目的タンパク量、および（2)IP条件の検討:IP前、IP後の抽出液、IPしたサンプルの目的タンパク量を見積もる これは、基本的にやることにしています。 ＞プロテアーゼ阻害剤、脱リン酸化阻害剤 加えています。Apyraseですか？！、ATP結合蛋白ではなにかたまにいい影響もありそうですね！ わたしもいろいろ試してきましたが、以下の（１）は (1)Triton X100やNP40等のdetergentを使うか否か、低張液もしくは等張液でホモジェナイズするか はとくに違いがあるようです。クロスリンカーはレビューアーからの批判が気になるので基本的にしていませんが。 ＞いろいろ書きましたが、漫然とCo-IPしても成功しないので、酵素反応と同じ？ように慎重に条件検討しましょう。 まさに、仰せのとおりですね。monさん、丁寧な解説をありがとうございます。

追加3 削除/引用 No.1100-6 - 2011/10/21 (金) 12:39:36 - mon 抽出液組成として検討すべき項目としてざっと思いつくのは、 (0)リン酸バッファーかTris、HEPES等か、NaClかKClか (1)Triton X100やNP40等のdetergentを使うか否か、低張液もしくは等張液でホモジェナイズするか (2)阻害剤、還元剤(DTT,b-ME)を添加するか否か (3)補因子(Mg,Ca,Zn,NADPH,Mg-ATP等)、を添加するか (4)クロスリンカーを使用するか否か (5)分画するか（核・細胞質・膜等） (6)液量はどれくらいか、タンパク定量を阻害しないか、測定範囲内か。 (7)抗体ー抗原の結合を阻害しないか？（Tritonが使えない抗体や相互作用もあります）。 いろいろ書きましたが、漫然とCo-IPしても成功しないので、酵素反応と同じ？ように慎重に条件検討しましょう。

追加２ 削除/引用 No.1100-4 - 2011/10/21 (金) 10:20:35 - mon IP時（あるいは抽出時）に阻害剤を添加することが有効な場合もあります。 有名どころでは、プロテアーゼ阻害剤、脱リン酸化阻害剤でしょうか。ATPを消費するApyraseを添加する場合もあります。

追加 削除/引用 No.1100-3 - 2011/10/21 (金) 10:15:54 - mon 条件検討しないIPは結果の解釈を誤りますので危険ですよ。 western blot等で、(1)抽出効率等の検討:全タンパク・抽出液中の目的タンパク量、および（2)IP条件の検討:IP前、IP後の抽出液、IPしたサンプルの目的タンパク量を見積もる ことは、必須です（毎回行なう必要はありませんが）。 結果によっては、抗体量を増やしたり、抽出液組成を変えたり(場合によっては分画したり）しましょう。

なんとも 削除/引用 No.1100-2 - 2011/10/21 (金) 09:57:02 - mon タンパク質の性質・量、抗体の親和性によるのでなんとも言えません。 35mm dishで十分なものをありますし、15cm dishで行なうときもあります。 遺伝子導入で一過性発現したタンパクは量が多いので、35mm dish(6well plate)でおつりがでます。 またIPしたタンパク(A)ではなく結合するタンパク(B)が見たい場合は、結合様式にもよります。 Aに結合するタンパクがB以外に沢山ある場合は、大量のAをIPしないとBが検出できません。 また、抽出法やそれに伴うIP液組成に影響も受けます。 0.1%SDSを加えて抽出し10倍以上に薄めて(抗体との結合を確保して）IPするなど、トリッキーなものもあります。結合を強めるためクロスリンカーを使用するとIPされる量が減ることがあります。

IP-ウエスタンに使う通常の細胞培養量 削除/引用 No.1100-1 - 2011/10/21 (金) 08:08:38 - コント IP-ウエスタンに使う通常の細胞培養量はどのくらいでしょうか？　私は10ｃｍプレート1枚ほどですが、あまりうまくいきません。少なすぎでしょうか？　私の不得意な手法です。 よく論文で見るのは、１０％のインプットで同じくらいのバンドが結合した画分にみえる、すなわち10％くらいが結合して見えるのがよくあるような気がします。これは0.1％でも良いと思われますか？ ちなみに、あきらかに１：１でコンプレックスを作っているとされるのは私でもうまくいくので、ある意味でのコントロール(人間のコントロール）は取れていると期待しています。また、何かコツがありましたら教えてください。

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