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細胞内pro-collagenの免疫染色について トピック削除
No.1089-TOPIC - 2011/10/19 (水) 09:21:55 - NN
いつもお世話になっております．免疫染色初心者です．

細胞内で合成されたpro-collagenを染色することとで，どの細胞がcollagenを合成しているか調べたいと考えています．
過去の論文を参考にしているのですが，なかなか上手くいきません．
(pro-collagenの細胞内における発現は，western等で確認しています)

おそらく，
・固定時に細胞内のpro-collagenが固定されずに流出している
・一次抗体(pro-collagenではなくcollagenの抗体を用いている)と抗原が上手く反応していない
といったあたりが原因ではないかと思っております．

そこで皆様に２点質問があります．

@細胞膜内に存在するpro-collageのような糖タンパクを固定するには,どのような固定法が効果的なのでしょうか？
論文を参考に４％ＰＦＡ１５min〜overnightは試しました．
ＧＡやＰＬＰは浸透性が弱く，細胞内のタンパクまでは固定できないと考えています．

Acollagenの抗体では，pro-collagenには反応しないのでしょうか？
いくつかの論文では，テロペプチドを抗原とするcollagen抗体を用いて，細胞内を染色しているため，ある程度反応すると思っていたのですが．
反応性が悪い場合，固定後プロテアーゼで賦活化は可能でしょうか？

長文となってしまいましたが，よろしくお願いいたします．
　
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(無題) 削除/引用
No.1089-3 - 2011/10/19 (水) 23:25:37 - ＮＮ
Harmonia様

ありがとうございます．説明下手で申し訳ありません．

> 「免疫染色」では検出できない、ということですか？
おっしゃる通りです．少なくとも，そもそも細胞内にpro-collagenがまったく存在しないということはないと思います．

> それなら、シグナルが仮に見えたとして、どうやってpro-collagenとcollagenを見分けるのでしょうか？
今回の実験系では，純粋に細胞がcollagenを合成・分泌する能力を有しているかを視覚的に示すことが目的です．そのため，collagen分子とその前駆体であるpro-collagenを厳密に見分ける必要はありません．むしろ両方染まっても問題ないと考えています．
一応，細胞内が染まればpro-collagen，細胞膜上や外部が染まればcollagenだと考えております．
ただ，細胞外に沈着するcollagenの量は微量であることが分かっているため，細胞内のpro-collagenを狙いたいと考えました．

> ＞論文を参考に４％ＰＦＡ１５min〜overnightは試しました
> のサンプルをWestern blotting すると、pro-collagenは確認できますか？
次回染色時に可能ならば試してみます．

(無題) 削除/引用
No.1089-2 - 2011/10/19 (水) 21:59:05 - Harmonia
言っていることが分からないぞ？

＞pro-collagenの細胞内における発現は，western等で確認しています

それなら、その抗体はWestern blottingとそのほかのあなたが秘密にしている方法ではpro-collagenを検出した。

「免疫染色」では検出できない、ということですか？

＞一次抗体(pro-collagenではなくcollagenの抗体を用いている

それなら、シグナルが仮に見えたとして、どうやってpro-collagenとcollagenを見分けるのでしょうか？

どのくらいしんどいことになるか分かりませんが、
＞論文を参考に４％ＰＦＡ１５min〜overnightは試しました
のサンプルをWestern blotting すると、pro-collagenは確認できますか？

細胞内pro-collagenの免疫染色について 削除/引用
No.1089-1 - 2011/10/19 (水) 09:21:55 - NN
いつもお世話になっております．免疫染色初心者です．

細胞内で合成されたpro-collagenを染色することとで，どの細胞がcollagenを合成しているか調べたいと考えています．
過去の論文を参考にしているのですが，なかなか上手くいきません．
(pro-collagenの細胞内における発現は，western等で確認しています)

おそらく，
・固定時に細胞内のpro-collagenが固定されずに流出している
・一次抗体(pro-collagenではなくcollagenの抗体を用いている)と抗原が上手く反応していない
といったあたりが原因ではないかと思っております．

そこで皆様に２点質問があります．

@細胞膜内に存在するpro-collageのような糖タンパクを固定するには,どのような固定法が効果的なのでしょうか？
論文を参考に４％ＰＦＡ１５min〜overnightは試しました．
ＧＡやＰＬＰは浸透性が弱く，細胞内のタンパクまでは固定できないと考えています．

Acollagenの抗体では，pro-collagenには反応しないのでしょうか？
いくつかの論文では，テロペプチドを抗原とするcollagen抗体を用いて，細胞内を染色しているため，ある程度反応すると思っていたのですが．
反応性が悪い場合，固定後プロテアーゼで賦活化は可能でしょうか？

長文となってしまいましたが，よろしくお願いいたします．
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