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(無題) 削除/引用 No.1083-13 - 2011/10/18 (火) 18:14:12 - tako 皆様、参考になる意見をありがとうございました。 他の結果からも、インサートの中のEcoRIサイトの消失が一番考えられそうです。 シークエンスして確かめてみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1083-12 - 2011/10/18 (火) 17:57:06 - ~ マップを書き直しても、フラグメントの数自体は変わりませんので問題は起きているのでしょうね。 MCSのKpnI、EcoRIの間は6bpあるので、どちらから切っても切れるでしょう。 そのため、次に考えるのは、同じサイズのはずれのインサート(EcoRIサイト無し)が入っていないかどうかかと思います。 やっているのはクローニングでしょうか？それとも、サブクローニングでしょうか？ また、何クローン試しているのでしょうか？ クローニングであれば、同じサイズの違うフラグメントを取ってきているのかもしれませんし、そもそも材料の生物にはEcoRIサイトがないのかもしれません。 また、試しているクローン数が極端に少ない場合、単にはずれを拾っているのかもしれません。 他の制限酵素サイトでチェックしてみるか、一足飛びにシークエンシングに進んでしまってはいかがでしょうか。 （ベクターの配列から読める範囲だけでも） 後者であれば、外れクローンであっても、状況の詳細がつかめるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1083-11 - 2011/10/18 (火) 17:52:33 - AP インサートの中にあるはずと思っていたEcoRIサイトが実はなかった、またはなんらかの原因で潰れた。結局EcoRIもKpnIも切れるのはクローニングサイトの一箇だけだった。

(無題) 削除/引用 No.1083-10 - 2011/10/18 (火) 17:05:48 - tako ＞インサートの向きによって、MCS上の制限酵素サイトから1kbのところで切れる場合と、2kbのところで切れる場合があるということですか？ ＞4kbのインサートで、右から1kb、左から2kbのところは一致しませんので、ベクターマップが書けないのですが… インサートの中のEcoRIサイトしか考慮していなかったので、KpnIの近くのEcoRIサイトを無視してマップを書いていました。 書き直してみます。

手抜きするなら 削除/引用 No.1083-9 - 2011/10/18 (火) 16:59:27 - mon 議論とは関係ないけど確認だけなら、手抜きでエタ沈なんかしないでTA buffer, NEB#4やTango bufferだけ使うね。Ｌ->Hなら10xBufferを加えるだけでもいける。

(無題) 削除/引用 No.1083-8 - 2011/10/18 (火) 16:59:26 - tako 使っているベクターはそれです。 ＞制限酵素サイトは、NdeI-KpnI-EcoRIと並んでいますので、NdeIとKpnIで切って、インサートを切り出せたということは、KpnIとEcoRIの間にインサートは無いことを意味しています。 クローニングサイトは、NdeIとKpnIの間にあります。なので、この二つでインサートの有無が確認できると思ったのですが・・・違うのでしょうか？ ＞KpnI、EcoRIのサイト間には6bpしかありませんので、インサートが入っていなければ、片方で切っても、両方で切っても、電気泳動で長さの違いを見るのは無理でしょう。 すみません、インサートの中に、EcoRIサイトがあります。 KpnIとの間は1kbくらいです。

どういうこと？ 削除/引用 No.1083-7 - 2011/10/18 (火) 16:55:19 - ~ ベクター約3kb、トータル7kbなので、インサートは約4kbですよね。 >うまくいけば、1kbと6Kbに、反対に入っていれば、2kbと5kbに分かれるはずのものです。 ベクターのMCSで1cutされた部分を基点に考えると、7kbの直鎖になりますよね。 インサートの向きによって、MCS上の制限酵素サイトから1kbのところで切れる場合と、2kbのところで切れる場合があるということですか？ 4kbのインサートで、右から1kb、左から2kbのところは一致しませんので、ベクターマップが書けないのですが…

ベクターとインサートの制限酵素サイトの位置を明記してください 削除/引用 No.1083-6 - 2011/10/18 (火) 16:28:43 - ~ http://www.merck-chemicals.jp/chemdat/en_CA/Merck-US-Site/USD/ViewProductDocuments-File?ProductSKU=EMD_BIO-69967&DocumentType=VMAP&DocumentId=/emd/biosciences/vectormaps/en-US/TB017VM.pdf&DocumentSource=GDS 使っているベクターはこれでいいのでしょうか。 >インサートが入っているかの確認で、KpnIとNdeIで2回に分けて切った時はちゃんと切れていた この書き込みがおかしいです。 制限酵素サイトは、NdeI-KpnI-EcoRIと並んでいますので、 NdeIとKpnIで切って、インサートを切り出せたということは、KpnIとEcoRIの間にインサートは無いことを意味しています。 KpnI、EcoRIのサイト間には6bpしかありませんので、インサートが入っていなければ、片方で切っても、両方で切っても、電気泳動で長さの違いを見るのは無理でしょう。 MCSにある制限酵素サイトではなく、インサート内の制限酵素サイトの話をしているのであれば、それを明記しましょう。

(無題) 削除/引用 No.1083-5 - 2011/10/18 (火) 16:16:20 - tako サイトが近接したところにあっても、切れていれば電気泳動でバンドとして見えるのではないのですか？ うまくいけば、1kbと6Kbに、反対に入っていれば、2kbと5kbに分かれるはずのものです。

(無題) 削除/引用 No.1083-4 - 2011/10/18 (火) 15:57:04 - AP 予断なく素直に考えれば、EcoRIサイトとKpnIサイトが非常に近接したところ（電気泳動で区別できない距離）に一箇所づつあるということでしょう。 このようなケースで順番に関わらず先に切った方だけが切れて、後のほうが切れないというのは考えにくそう。自分の頭の中に描いたデザインに囚われてものを見ているからそう考えたのかもしれませんが、意図しない構造のものが取れてくることはよくあります（だからこそ、そうやってチェックするんですが）。たとえば、制限酵素末端が何らかの形で削れた状態で連結していることもあります。 どう言うケースが考えられるか、それは説明がうまくないので推理できません。 「X kbのXXX酵素-YYYY酵素断片をpT7 blueのwww酵素,vvv酵素サイトに入れた」とか、それぞれの制限酵素消化がどこを切ってどのように方向が決めようという計画なのかとか。

(無題) 削除/引用 No.1083-3 - 2011/10/18 (火) 15:50:28 - が つまりインサートが逆に入って、KpnIとEcoRIが近所にあるんで、見た目切れていないように見えるのでは？

補足 削除/引用 No.1083-2 - 2011/10/18 (火) 14:24:42 - tako 制限酵素処理は、すべて37℃で1h反応させています。

2つ目の制限酵素処理で切れない 削除/引用 No.1083-1 - 2011/10/18 (火) 14:09:08 - tako はじめまして pT7 Blueベクターを使った実験をしています。 制限酵素 EcoRIとKpnIを使ってインサートの方向が正しいか見たいのですが、L Bufferを使ってKpnIで切れたか確認（7kb）した後、エタ沈をしてH Bufferを使ってEcoRIで処理したのですが、変わらず7kbのままでした。 試しに、EcoRIで最初に切って、次にKpnIで処理してみましたが、EcoRIでは切れているのにKpnIでは切れていないという結果でした。 ちなみに、インサートが入っているかの確認で、KpnIとNdeIで2回に分けて切った時はちゃんと切れていたので、操作の方は大丈夫だと思います。 何か気をつけることや、原因が分かる方がいらっしゃいましたらご教授ください。よろしくお願いします。

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