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(無題) 削除/引用 No.1073-5 - 2011/10/16 (日) 07:12:16 - kiyo 皆様ありがとうございます。 ＞774さん 書き方が不正確でした。約2倍というのは、インサートの2倍の位置にバンドが見えたということです。コントロールは置いていますが、ベクターの脱リン酸化はしていません。 ＞モモさん、カイさん 以前、2つの制限酵素で切り出したときは今回のプロトコルで上手くいっていました。1つの制限酵素というのが問題でしょうか。 インサートのリン酸化、ベクターの脱リン酸化を行い、モル比を3:1~10:1あたりで検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1073-4 - 2011/10/15 (土) 07:15:41 - カイ 100：1ですかー。 多すぎません？ オリゴDNAをアニーリングさせてライゲーションって小さいフラグメントの時はよくするんですが、私はリン酸化させて3：1〜10：1でやってます。 私が使ったのは60〜65merくらいだったかな。 ひとつの制限酵素というのも危険ですね。 インサートも両端に同じ制限酵素のサイトがついているということですよね。 A-B　（A, Bは制限酵素のサイトだと思って）と違うサイトだったら A-B + B-A　＋A-B　にならないとベクターに入らないけど、 インサートが　A-Aという状況だと　A-Aがいくつでも入り得ますね。 あとベクターは脱リン酸化したほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1073-3 - 2011/10/15 (土) 06:57:46 - モモ インサートをリン酸化するのが簡単な気が・・・

(無題) 削除/引用 No.1073-2 - 2011/10/15 (土) 02:38:51 - 774 ＞約２倍の位置にバンド これはベクターが2量体をつくっているのでは？ ベクターは脱リン酸化してますか？またセルフライゲーションのコントロールはおいていますか？ シングルカットの場合、ベクターを脱リン酸化しないとセルフばかりになる木がしますがいかがでしょうか？

ライゲーションについて 削除/引用 No.1073-1 - 2011/10/14 (金) 21:04:29 - kiyo 100merのオリゴDNAをアニーリングし、ベクターにライゲーションを行っていますが、目的の鎖長が得られていません。 ベクターは一つの制限酵素で切り出し、泳動後精製しました。インサートはリン酸化せずに、インサート:ベクターのモル比を100:1でライゲーションしました。5つずつコロニーを拾い、mini prep後、２種類の制限酵素で処理した所、目的の鎖長の位置ではなく、約２倍の位置にバンドがあるサンプルを1つ確認しました。これはインサートの重複と考えた方が良いんでしょうか？その後モル比を何点か振りましたが、結果は同じでした。 ロングオリゴの場合は、アニーリングbufferの塩濃度を半分にすると良いなどあるようですが、アニーリング条件の検討をした方がよいのでしょうか。（自作のbufferで、サーマルサイクラーでアニーリングしています。） ピックアップするコロニーを増やして実験を行おうとは考えているのですが、アドバイスいただければと思います。 よろしくお願い致します。

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