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PCR template量　できるだけ多くしたい（SELEX） トピック削除
No.1069-TOPIC - 2011/10/14 (金) 16:32:00 - Ta-bo
ランダム配列を持つtemplate DNAを、できるだけ多くの種類増やしたいと考えています。

Extaqを用いた以下のプロトコールを見つけましたが、もっと増やしたいのです。
滅菌水 611μL
100μM template DNA 5
100μM リバースプライマー 30
10×反応バッファー 　　　　 80
dNTPs 　　　　　　　　　　　　64
5U/μL Takara Extaq 　　　　　10
合計800μL

この100μM template DNA の量を5ではなく、100くらいにしたいのですが、
スケールアップするほかないでしょうか？
その場合800*20=16mlの系になって結構大きくなってしまいます。
このまま800μLの系でtemplate量だけ増やす事は可能でしょうか？

ちなみにやろうとしている実験は、SELEX(試験管内進化法)という手法です。
　
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PCRでなくて線形増幅のようですね 削除/引用
No.1069-3 - 2011/10/17 (月) 18:10:31 - ふみ
長いtemplate (フォワード)に短いリバースを貼りつけてのprimer extensionを計6回(あるいは1回あたりの効率が高くないことを考慮してもっとたくさんの回数)やろうという感じでしょうか。

他の条件をそのままにtemplateの量を増やすと、complexityとcopy numberのトレードオフになる可能性が高いです。complexityを増やしても各配列1copyずつしかなければ、最初のラウンドで落としてしまう高活性の配列が多くなってしまいそうです。
そんなわけで、templateの相対量はあまり極端に上げない方が良さそうだと思います。

反応容量が大きくて面倒くさいことについては、ファルコンチューブとかで手動PCRのようなつらい実験をするのでなく、PCRプレートに連続分注ピペットで分注すれば良いと思います。ファルコンでやるよりも反応効率も良くなりますし。

スケールアップのネックは、上で触れた反応スケールそのものの問題に加えて、先に回答した人が指摘したようにコストの問題もあります。
これについては、ExTaqでなく普通のTaqにしたらどうでしょうか。短い核酸を作るのにエラーレートはあまり大きな問題にならない筈ですし、ランダム配列ではエラーが入っても全く問題ありません。

(無題) 削除/引用
No.1069-2 - 2011/10/17 (月) 14:35:15 - ~
最終的には非特異のアニーリングがどこまで起きるかで決まるでしょうから、
やってみるしかないでしょうとしか言えませんが。

スケールアップでコストがネックになっているのであれば、おそらく一番金のかかっているDNA polymeraseは、半分以下に出来るかと思います。

また、どういう反応をしたいのか分かりませんが、プライマーのモル数が現時点でテンプレートの６倍で、プライマーを1種類しか入れていませんよね。
PCRというからには両側に同じプライマーが結合するのでしょうか？
そうであれば、1サイクル目でテンプレートの2倍のモル数のプライマー
2サイクル目でテンプレートの4倍のモル数のプライマーが使われるので、
2サイクルでプライマーのほとんどが使い切られることになりますね。
この系であれば、テンプレートだけを増やすのであれば、3倍で頭打ちになるのではないでしょうか。
（1サイクルで終わりなので、高いtaqではなく、T4 DNA polymeraseに切替えられるかも）

プライマーも増やすのであれば、後は非特異がどのくらい起きるかどうかで、それはテンプレート、プライマー次第でしょう。

PCR template量　できるだけ多くしたい（SELEX） 削除/引用
No.1069-1 - 2011/10/14 (金) 16:32:00 - Ta-bo
ランダム配列を持つtemplate DNAを、できるだけ多くの種類増やしたいと考えています。

Extaqを用いた以下のプロトコールを見つけましたが、もっと増やしたいのです。
滅菌水 611μL
100μM template DNA 5
100μM リバースプライマー 30
10×反応バッファー 　　　　 80
dNTPs 　　　　　　　　　　　　64
5U/μL Takara Extaq 　　　　　10
合計800μL

この100μM template DNA の量を5ではなく、100くらいにしたいのですが、
スケールアップするほかないでしょうか？
その場合800*20=16mlの系になって結構大きくなってしまいます。
このまま800μLの系でtemplate量だけ増やす事は可能でしょうか？

ちなみにやろうとしている実験は、SELEX(試験管内進化法)という手法です。
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