ご指摘のとおり、セミドライは初心者で経験がほとんどありません。今まで一貫してwetでやってきました。以下が今回試した条件です。Wetのときは高分子の蛋白の転写は完全ではありませんでしたが、９０Kdぐらいまではほぼ完璧でした。今回TransBlot購入にあたりprecast gel、preset membraneをサンプルとして渡され、あまりの転写効率のよさに愕然としました。しかしラボとしてコスト問題や学生の教育的な観点から、できれば自前のゲルとメンブレンでもある程度使える条件を確立したいと考えいろいろ試行錯誤している状況です。もし同様の考えでいろいろ試されている方がおられましたら、われわれの条件と比べていただいて助言をいただけると幸いです。
Hand Cast Gels
10% Gel (the amount is for two 1.5mm gels)
Resolving Gel Mix:
7.0 mL H2O (diH2O)
5.7 mL 30% Acrylamide (BioRad)
4.2 mL Lower Gel Buffer (0.75 M Tris, 0.2% SDS, pH 8.8)
94 uL 10% APS
15 uL TEMED
Stacking Gel Mix
3.6 mL H20 (diH2O)
0.886 mL 30% Acrylamide (BioRad)
1.5 mL Upper Gel Buffer (0.5M Tris, 0.4% SDS, pH 6.8)
27 uL 10% APS
8 uL TEMED
Running Buffer
BioRad 10X (25mM Tris/ 192 mM Glycine/ 1% SDS, pH 8.3)
Running Conditions:
140V for 50 to 70 mins
Transfer Membrane
PVDF from BioRad
Transfer Buffer
Towbin Buffer:
0.025M Tris
0.2M Glycine
0.01 SDS
20% Methanol
Transfer Conditions:
25V, 1.0A, 30 , 45, 60 mins |
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