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(無題) 削除/引用 No.1066-7 - 2011/10/15 (土) 21:27:59 - AKIRA コメントありがとうございます。 『自然に「ホァ〜」』はとても分かりやすかったです・・・。コラゲナーゼ濃度をもう少し濃度をあげてみるのも選択肢になりました。コラゲナーゼDやtype4の方が細胞に優しいようですね。ピペッティングの重要性も再確認しました。 練習あるのみというお言葉が響きました（笑）。有益な情報が得られたので、いくつか改善点を見直して練習したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1066-6 - 2011/10/15 (土) 19:01:54 - 脂肪 コラゲナーゼ濃度が薄くないですか？ 0.05%〜0.1%でやってる人が多いと思います。 消化がうまくいかないと生存率は下がりますよ。 だいぶ前に間違えて0.2%の濃度でやってしまったことがありますが、消化時間が5分で済みました（苦笑） 使った酵素液は２５ｃｃくらいでしたね。 生細胞は3x10^7個くらいでした。 あとはやはり、カニューレーションを門脈からやるかIVCからやるかでも生存率やyeildは全然違うようです。

練習あるのみ 削除/引用 No.1066-5 - 2011/10/15 (土) 15:39:41 - せ 低速遠心だけで80-90%のviabilityは丁寧にすれば，得られますよ。ピンセットで肝臓をちぎるのではなく，被膜だけを破って，自然に「ホア〜っ」とbuffer中に浮遊してくる細胞だけを集めるようにすれば，viabilityは上がりますよ。肝臓側に残ったものは、捨ててしまう。確かに丁寧なgentlyなパイペッティングは命ですね。基本的に，パーコールは必要ないですね。あと、トリプシンインヒビターも、ここ6-7年使ったことがありません。コラゲナーゼDだけなら、多少長くなっても細胞にダメージはないです。コラゲナーゼPを混ぜたカクテルなら、還流時間はクリティカルになります。

(無題) 削除/引用 No.1066-4 - 2011/10/15 (土) 12:23:39 - AKIRA コメントありがとうございます。 書き忘れましたがコラゲナーゼはWorthington社Type1を30mg/100mlの濃度で用事調整しています。 確かに17分は長めと思うのですが、なぜかこのくらいでないと肝臓が柔らかくなってくれません。ピペッティングは影響大なのですね・・・。ピペッティングよりもピンセットでちぎる方をメインにした方がよいのでしょうか。トリプシンインヒビターは入れいていませんが、効果的なら要検討ですね。 バッファーの組成はA. Ward, D. Tosh (eds.), Mouse Cell Culture, Methods in Molecular Biology 633を従っています。 酵素液還流時に肝臓が膨れるのは観察しています。www.mouselivercells.comも知っております。これに従ってPV挿入→IVC脱血、HBSSベースの液に変更してみますかね・・・。 生細胞は1匹あたり1,000,000前後がいいところです。色々見てみると、うまくいけばviability80%以上、絶対数でもあと20-30倍はとれるようですね・・・。 他にもポイントがありましたらご教授頂ければありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.1066-3 - 2011/10/15 (土) 11:57:03 - 脂肪 Percoll等を使って密度勾配遠心すると、生細胞を濃縮できます。 マウスでIVCからカニューレーションをした時に、低速遠心だけで生存率が50%を超えたことは私はないです。 あとカテーテル挿入の位置ですが、なるべく肝臓の近くにしないと腎静脈の方向に圧力が分散されてしまって、うまく肝臓が灌流できません。 消化も不十分です。 酵素液灌流スタート後５分くらいで肝臓がぷくぅ〜って膨れてくるのがいい感じなんですが、それは観察されてますか？ 英語で"mouse liver perfusion"でググるとビデオとか見れますよ。 あと灌流液と酵素液はHanksを使うのが一般的ではないかと思います。 確かNaHCO3が入ってると空気中のCO2との関係で緩衝能が高くなった気がします。 でもHEPES入ってるから大丈夫なのかな？どうなんですかね？

(無題) 削除/引用 No.1066-2 - 2011/10/14 (金) 16:39:08 - チョコパイ ずいぶん前にも同じような質問がありましたね。 ぱっと見た感じでは、還流が17分というのが、長すぎるように思いますが。 あとは、細胞を懸濁するときのピペティング操作を、どれだけ慎重にやってるかとか。（４番以降の操作のことです） コラゲナーゼ液には、トリプシンインヒビターは入れてないのですか？

マウス肝細胞初代培養でviabilityが悪い 削除/引用 No.1066-1 - 2011/10/14 (金) 06:17:45 - AKIRA よろしくお願いします。 マウス肝細胞をコラゲナーゼ還流でisolationして培養を試みていますが、トリパンブルーで生細胞が10%程度しかいません。 長くなりますがプロトコールです。 1.還流液A（37度）で5分間還流 2.コラゲナーゼ液（37度）で17分還流 3.胆嚢を取り除き、柔らかくなった肝臓を切除 4.ペトリdishで肝組織をちぎるように細かくし、10mlのピペットで5-6回程度ピペッティング 5.70μmフィルターを通し、50rcfで5分遠心 6.supを捨て、50rcfで5分遠心 7.supを捨て、50rcfで5分遠心 8.得られたペレットをトリパンブルーでチェック 還流液A (pH 7.4)： PBS(-) + 10mM HEPES + 5mM KCl + 0.1% glucose + 2mM EDTA コラゲナーゼ液 (pH 7.4)： PBS(-) + 10mM HEPES + 5mM KCl + 0.1% glucose + 10mM CaCl2 還流はIVCにカテーテル挿入→肝上のIVCをクランプ→門脈を切って脱血　の順番です。肝うっ血や空気の混入は注意を払っています。 どなたかviability改善のポイントを教えて頂ければ幸いです。

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