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(無題) 削除/引用 No.1050-10 - 2011/10/13 (木) 19:33:07 - 肝 HepG2は、DMEMで大丈夫でしたっけ？non-essential amino acidsが必要だったような記憶がありますが、昔は加えられてませんでしたか？血清中にもアミノ酸は当然あるので、そこからサプライされることもあるのでしょうが、加えた方が無難です。また、ポリリジンコートをしないとろくに接着しなかったような気がします。

(無題) 削除/引用 No.1050-9 - 2011/10/12 (水) 19:37:44 - TMO ＞~様 こちらも説明不足で申し訳ないです。 たしかに細胞のストック前の条件は確認しておりませんので、確認してみます。 2年ほど前から同じ条件でHepG2細胞を使用しているのですが、どうも最近状態が悪く悩んでいるところです。 やはり細胞の活きが悪いのが原因のようですね。

(無題) 削除/引用 No.1050-8 - 2011/10/12 (水) 14:22:15 - ~ >ストック前といいますとどういうことでしょうか？ 今のところ、ストック前にどのような条件で培養されていたのかが記載されていません。 ストック前に”いい”条件で飼われていたために、今の条件では条件が悪く増えないのかもしれません。 細胞を扱うのであれば、セルバンクに書かれている条件よりも、前に飼っていた条件を参考にしたほうがいいかと思います。 >自家蛍光 書かれている情報からは検討内容が分からなかっただけです。 十分な検討がされているのであれば、細胞の生きの悪さが原因なのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1050-7 - 2011/10/12 (水) 12:58:41 - TMO ＞~様 ストック前といいますとどういうことでしょうか？ ほかの細胞を使っている人に聞いてみたところ、以前は増えにくいことがあったが現在は正常に増えると聞きました。培地、血清ともに同じロットのものを使用しているので、細胞側に問題がある可能性があると思うのですが…。 たしかに、培養ディッシュに関しては、接着しやすいものとそうでないもとがあるようです。先日、IWAKIの12ウェルプレートで培養したところ、BDファルコンの培養フラスコで培養したときよりも接着が良いような感じがしました。 こちらも検討してみます。 自家蛍光は共焦点顕微鏡で観察しました。蛍光顕微鏡と含め、4種類の顕微鏡で観察しましたが、どれも570nmをピークに強い自家蛍光があります。励起光は405,488nmなど、短波長側のレーザーを用いています(量子ドットを利用しているため)。コントロールは用いていないので、厳密な比較はできませんが、細胞質全体が自家蛍光を発しているため、目的のモノの観察ができません。メーカーに依頼して観察を行っていただいたときもかなり強い自家蛍光でうまく観察できませんでした。このときは細胞の状態が悪いのではないかというアドバイスをいただきました。

(無題) 削除/引用 No.1050-6 - 2011/10/12 (水) 12:16:55 - ~ >培地には問題がないのではないかと思います。 これは、ストック前の培地が同じかを確認してみないとなんともいえないと思いますが。 >ほかの細胞も増殖しにくいといったことが起こっているようですので 血清もそうですが、 炭酸インキュベーターの温度や炭酸濃度もチェックしたほうがいいかもしれません。 また、昔、細胞培養用ディッシュなのに、全く貼り付かないディッシュを見た事があります。ディッシュの具合が中途半端に悪いのかもしれません。 >自家蛍光は、論文を参考にしていますが どのような操作をされていて、どのような経験があり、何をコントロールとしているのか分かりませんが、 書かれている情報からは、問題が細胞側なのか、顕微鏡側なのかを推測できないかと…

(無題) 削除/引用 No.1050-4 - 2011/10/12 (水) 11:25:17 - TMO ＞mon様、~様 早速のご返信ありがとうございます。 使用している培地はSIGMA-AldrichのDMEMです。FBSを10％、PSを1%加えてあります。グルタミン添加のものを使用しています。 ですので、培地には問題がないのではないかと思います。 ただ、ほかの細胞も増殖しにくいといったことが起こっているようですので、血清に問題があることは考えなくてはならないかもしれません。 細胞の凍結保存については、起こした後しっかりと接着しているようなので、問題はないかと思いますが、起こした後にほとんど増えないので、性質が変わっているのかもしれません。 新しい細胞を購入することを検討してみます。 自家蛍光は、論文を参考にしていますが(論文のものもスペクトル分離などで自家蛍光のスペクトルを除去していると思いますが･･･)、細胞固定を行っていなくても、自家蛍光がかなり強いので、なんらかの問題が起こっているものだと考えています。

(無題) 削除/引用 No.1050-3 - 2011/10/12 (水) 09:21:07 - ~ 自家蛍光の強弱は、何と比較した場合なのでしょうか？ ここから原因追求に向かうのは難しいと思いますが… 素直にトラブルシューティングをするのであれば、チェック項目としては �@培地の組成がおかしい（グルタミン添加忘れ、もっとリッチな培地で飼っていた） �A血清のロットがあっていない �B細胞が凍結前・中にダメージを受けていた などがあるかと思います。 �@は、ストック時の記録の確認と、monさんの書かれているように他の細胞での培養チェックで分かると思います。 �Aは、当時使用していたロットの血清が凍結保存されていればいいのですが、無い場合は他の細胞が増えるかで判断するくらいでしょうか。 �Bだとどうしようもありません。 別ロットでストックしたものがあればそれを試してみましょう。 なければ、買いなおすのが一番の近道かと。 目的によっては、しばらく待って増えてきた細胞集団（またはシングルクローン）を使うことが出来るかもしれませんが、元の細胞と性質が変わっているかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1050-2 - 2011/10/12 (水) 09:09:26 - mon 使用している培地は問題ないでしょうか。DMEM+10%FBSと思いますが、他の細胞は増えますか？ グルタミン未添加の培地もありますから。

HepG2細胞の培養 削除/引用 No.1050-1 - 2011/10/11 (火) 23:40:53 - TMO HepG2細胞を培養しているのですが、細胞の増殖が良くありません。 フラスコには正常に接着しているのですが、ほとん増えてきません。 マイコプラズマに感染しているのではないかと思い、検出キットを買ってみたのですが、マイコプラズマは陰性でした。 一つ気になるのは、共焦点顕微鏡での観察で自家蛍光が非常に強くなってしまうことです。 細胞の固定化には４％ホルムアルデヒドを用いていますが、これによっても多少自家蛍光が強くなってしまうようですが、論文でも同様の方法で固定化を行っているようですので、特に問題はないのではないかと思います。 細胞が古くなったり、培養条件で自家蛍光が強くなってしまうことがあるということを聞いたのですが、このようなことを経験された方はいらっしゃいますか？ 細胞は2007年に購入後、継代し、液体窒素中で保存していたものです。 何かご存知であればご教授お願い致します。

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