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(無題) 削除/引用 No.1047-9 - 2011/10/12 (水) 14:18:04 - ~ >テンプレート量は、変更なし＆以前増えたサンプルを >同量使って同じ結果になるのを確認しているので >問題ないと思います。 テンプレートも繰り返し使うと増えなくなることがあります。 小分けで使いきりにしているのでなければ、再調整も視野に入れた方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1047-8 - 2011/10/12 (水) 14:07:46 - ほぷほぷ プライマーがヘタれている可能性があるように感じます。

ありがとうございます。 削除/引用 No.1047-7 - 2011/10/11 (火) 23:01:08 - a アニーリング温度、時間、プライマー、酵素、 テンプレート量 がポイントと考えられるということですね。 monさん、KYさん、7744さん、ありがとうございます。 テンプレート量は、変更なし＆以前増えたサンプルを 同量使って同じ結果になるのを確認しているので 問題ないと思います。 プライマーは、とりあえず今あるだけの組み合わせ を試してだめだったので、他条件をいじってだめであれば 設計/発注を考えます。 とりあえずは、アニーリング温度/時間の変更という 方向で間違っていないようなので、それで進めてみます。 プライマーがきちんとアニーリングしていないのが 問題なのかと思い、aneel温度低め／時間長めにしようかと 考えていたので、可能性低い方向にトライする所でした。 ありがとうございます。 非特異増幅が起こっていると解釈すべきなのですね。 アニーリング条件変更でだめであれば、 すぐにプライマー、酵素変更に切り替えようと 思います。 アドバイスありがとうございました。

KYさんと同じです 削除/引用 No.1047-6 - 2011/10/11 (火) 22:32:05 - 7744 以前増えていたことは一度忘れて、プライマーの確認・変更、酵素の変更などが一番手っ取り早くてよいのではないでしょうか？ もしお金の問題があるとして自分ならどうしてみるかと考えたら、（特別な酵素を使っている場合を除き(KOD等)）PCR条件のアニーリング温度以外は問題無いかと思います。変更するならアニーリング温度ではないでしょうか？ プライマーのTm値をもう一度見直してアニーリング温度が低すぎないか確認してみてください。 どちらか低い方のTm値をアニーリング温度にしても十分ワークします。あるいは場合によってはそれよりも多少高くても大丈夫です。 あともう一つ。 テンプレートの量は以前と同じなのですか？ 適当な感じでゲノムを入れると、多すぎて走らない場合がありますよ？

(無題) 削除/引用 No.1047-4 - 2011/10/11 (火) 22:17:53 - KY 個人的な経験では温度やバッファー条件をちょっといじってもうまくいかいのであれば、 １、ＰＣＲ酵素を変える ２、プライマーを変える これらの方が劇的な改善がみられることが多いです。

(無題) 削除/引用 No.1047-3 - 2011/10/11 (火) 18:06:22 - mon すいません、目的バンドが出ていないのですね。同じ対処法を試してください。

(無題) 削除/引用 No.1047-2 - 2011/10/11 (火) 17:43:59 - mon 目的のバンドは増えている場合のスメアになる場合の対処法として、アニーリング温度を上げる（時間を短くすることもある）、Mg濃度を下げる等を行っています。 アニーリング時間30秒は長いので5~10秒程度に短くするか、アニーリング温度を上げる（タッチダウンの最終ステップも）かしてみてはいかがでしょうか。10-25uLの液量でアニーリング時間1秒という反応を行うときもあります。

PCRでバンドがどうしてもでない。 削除/引用 No.1047-1 - 2011/10/11 (火) 17:03:25 - a とある遺伝子のPCR産物がどうしてもスメア状になるという現象に 悩まされています。 同サンプルから、ほかの遺伝子のPCRを行っても問題ないので、 PCR条件が問題なのだと思うのですが、 意見をお聞きしたいのです。 PCR産物サイズは２kbなのですが、 それよりもサイズが小さい所に、もやっと太い 帯状のバンド・・・というかシグナルが見られます。 帯の位置は同じサンプルから増やしたものの間でも バラバラです。あるものは、５００bp付近、あるものは 1000bp付近・・・と行った具合に帯が見られます。 プロトコルは、タッチダウンからの、 95℃30s 55℃30s 72℃2分半 で行っています。 そして、実は、過去に一回適当なPCR条件で行って、 全く問題なく増えたのです。 が、そのプロトコルを消されてしまいまして・・・。 伸長時間は２分半だったと 思いますが、アニーリング温度／時間は不明です。 このアニーリング条件で問題あるでしょうか？

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