BioTechnicalフォーラム [組み換えタンパクが発現しない]

組み換えタンパクが発現しない

No.1041-TOPIC - 2011/10/10 (月) 20:10:24 - ゆずゆ

いつもこちらを利用させてもらっています。
こちらで頂いたアドバイスから、放線菌の全配列を調べることが出来ました。次に、大量発現系の構築を行っているのですが、タンパクが発現しません。

約2000bpの放線菌遺伝子をpColdⅠとⅡに組み込み、コロニーPCRでインサートが入ったのを確認しました。

次に、1mM IPTGを加えてから15℃で培養し、超音波破砕後、SDS-PAGEで泳動しました。

私がわからないのは下記のようなことです。
①約2000bpのものを約4000bpのベクターに組み込み、自分の配列中から作ったprimerとM13 primer(BigDye3.1に付いていたもの)でコロニーPCRして増えたものが約1500bpだったが、それくらいの大きさになるのか？
また、2種類の制限酵素で切ったが、逆向きに入ることはあるのか？
また、M13 primerの種類によって使い分けしたほうが良いか？

②大腸菌の生育が遅いのは何故か？（全てではありませんが、ばらつきが出ます）

プラ抽してシーケンスを読めば早いのですが、プラ抽も上手くいかず、途方にくれています。

どうぞ、アドバイスをお願いします。
　

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お

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No.1041-9 - 2011/10/13 (木) 16:11:34 - ゆずゆ

コンストラクト作成は問題ないと仮定して。
蛋白発現からの問題なら。
ホストを検討する。

理論上、DH5でも発現するはずだと思いますが、Rosseta-BL21に変えないとまともな蛋白が発現しませんでした。＞

pColdベクター自体は大腸菌株を選ばず、発現が可能とありますが、クローニング用の大腸菌株では発現しないのですか・・・。
みさんのいうとおりにホストをBL-21に変えることを検討したいと思います。

お返事わざわざありがとうございます。

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No.1041-8 - 2011/10/13 (木) 16:08:08 - ゆずゆ

> 配列はpColdベクターのM13 intergenic regionにつくと思います。
M13 intergenic regionはMCSから結構離れているので、もう片方のプライマー次第では1500 bpは妥当かもしれませんし、おかしいのかもしれません。これは、設計した本人にしかわからないです。また、M13 primerがM13IGのどこにつくのかもわからないので、何ともいえないです。＞

自分の配列の開始コドンから20bp位のプライマーを使っていて、自分の配列の全長は1400bpくらいです。コロニーPCRで増やした配列を読んで、プラスミドとつながっているかを今調べています。配列は入っていましたので、全長が確認できてから次に進みたいと思います。

発現はSDS-PAGEだけではなく、Western Blottingでも確認したほうがよいです。
pColdベクターのマニュアルのトラブルシューティングもよく読んで、解決策を模索するのも重要なことです。発現しない時の対処法は試したのでしょうか？＞

トラブルシューティングにある中で、IPTGを入れるタイミングや、冷却時間などをいじってみましたが、変わりませんでした。ウェスタンブロッティングもやってみようと思います。

(無題)

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No.1041-7 - 2011/10/13 (木) 14:17:01 - み

コンストラクト作成は問題ないと仮定して。
蛋白発現からの問題なら。
ホストを検討する。

理論上、DH5でも発現するはずだと思いますが、Rosseta-BL21に変えないとまともな蛋白が発現しませんでした。

(無題)

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No.1041-6 - 2011/10/13 (木) 04:15:21 - ab

> 配列はpColdベクターのM13 intergenic regionにつくと思います。
M13 intergenic regionはMCSから結構離れているので、もう片方のプライマー次第では1500 bpは妥当かもしれませんし、おかしいのかもしれません。これは、設計した本人にしかわからないです。また、M13 primerがM13IGのどこにつくのかもわからないので、何ともいえないです。

発現はSDS-PAGEだけではなく、Western Blottingでも確認したほうがよいです。
pColdベクターのマニュアルのトラブルシューティングもよく読んで、解決策を模索するのも重要なことです。発現しない時の対処法は試したのでしょうか？

とりあえず、部分的にでもシークエンスが読めているようなので、全長が確認できてから次のステップに進んだ方が確実です。

お返事わざわざありがとうございます。

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No.1041-5 - 2011/10/12 (水) 14:31:26 - ゆずゆ

配列がわからないのですが、pColdベクターのMCS前後にM13プライマーがつくのでしょうか？
それとも、M13 intergenic regionにつくのでしょうか？>

配列はpColdベクターのM13 intergenic regionにつくと思います。

ホストの大腸菌は何を使ってますか？
タンパク質発現用の大腸菌では、うまくプラスミドがとれないと思うのですが。
逆に、クローニング用の大腸菌では、内在性のプロテアーゼで分解してしまって、SDS-PAGEではみれないこともあります。＞

ホストの大腸菌はJM109株を使っています。クローニング用なので、プラスミドが取れないのは自分の腕だと思いますが、プロテアーゼ分解されてしまっているのでしょうか・・・。

> ②大腸菌の生育が遅いのは何故か？（全てではありませんが、ばらつきが出ます）
IPTGがなくても基底状態で発現することがあり(leak）、そのタンパク質が大腸菌に毒性があれば生育が遅くなる事もあります。＞

発現させようとしているタンパク質はポリアミンなのですが、細胞毒性があるから生育が遅くなっているのでしょうか・・・。

いずれにしても、コロニーPCRだけであたりを決めるのは危険なので、クローニング用の大腸菌でプラスミドを抽出して、制限酵素処理なり、シークエンスを読むなりして確認しないといけませんね。＞

コロニーPCRでインサートが確認できたもののシーケンスを読みました。
自分の配列は確認できたのですが、開始コドンからは入っておらず、（ただ読めていないだけなのかもしれませんが）、入っている向きやつながっているのかは今調べている途中です。

(無題)

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No.1041-4 - 2011/10/12 (水) 03:47:29 - ab

配列がわからないのですが、pColdベクターのMCS前後にM13プライマーがつくのでしょうか？
それとも、M13 intergenic regionにつくのでしょうか？

ホストの大腸菌は何を使ってますか？
タンパク質発現用の大腸菌では、うまくプラスミドがとれないと思うのですが。
逆に、クローニング用の大腸菌では、内在性のプロテアーゼで分解してしまって、SDS-PAGEではみれないこともあります。

> ②大腸菌の生育が遅いのは何故か？（全てではありませんが、ばらつきが出ます）
IPTGがなくても基底状態で発現することがあり(leak）、そのタンパク質が大腸菌に毒性があれば生育が遅くなる事もあります。

いずれにしても、コロニーPCRだけであたりを決めるのは危険なので、クローニング用の大腸菌でプラスミドを抽出して、制限酵素処理なり、シークエンスを読むなりして確認しないといけませんね。

私なら、Harmoniaさんの5のステップでもう一度配列を読みます

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No.1041-3 - 2011/10/11 (火) 08:36:26 - ~

>コロニーPCRして増えたものが約1500bpだったが、それくらいの大きさになるのか？
これは質問として成立するのでしょうか？
プライマーの片方は貴方が設計したものですよね。
>自分の配列中から作ったprimerとM13 primer
貴方がどこに設計したのかが書かれていない以上、増幅産物の大きさを答えられる人はいないのでは…

>2種類の制限酵素で切ったが、逆向きに入ることはあるのか？
削れてから入ることもありますので、確認もしていない向きがあっていると考える根拠は無いでしょう。

>M13 primerの種類によって使い分けしたほうが良いか？
使い分ける場面があるのかもしれませんが、
この場合で使い分ける必要があるとすれば、どちらのプライマーがインサート内にアニールした可能性があるかどうかの検証用くらいではないでしょうか。

>大腸菌の生育が遅いのは何故か？
インサートが大きいと増殖速度が遅いことはあります。
プレートの端のほうは増殖が遅いことがあります。（栄養分の拡散の問題？）

>プラ抽してシーケンスを読めば早いのですが、プラ抽も上手くいかず、
コピー数の問題でしょうか？
プラスミド抽出が出来ていないのであれば、目的のコロニーが本当にプラスミドを持っているのか、たまたまコロニーPCRで大腸菌外のフラグメントを増やしてしまっているのかが確認できていないのでは？

(無題)

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No.1041-2 - 2011/10/10 (月) 22:40:39 - Harmonia

僕が同じことをするなら次のような手順でします。

１．PCR による遺伝子のゲノムDNAからの増幅。ただし、スプライシングを考慮する必要がないとして。
２．クローニング用ベクターpGEMとかpUC19とかへのクローニング。
３．制限酵素と配列確認によるクローンの同定。
４．クローニングベクターからの目的断片切り出しとそれに続けて発現ベクターへの目的断片への組込み。
５．制限酵素による発現ベクターのチェック。
６．発現用宿主への発現ベクターの導入と発現誘導。

４は、5'側と3'側に異なる酵素を利用します。それによって、組込みに向きを単一にできます。そのためには、１で酵素配列込みのプライマーを作っておきます。
２の組込みは平滑末端のサイトに組み込むことが多いです。そこで、KOD plusなど、Aが付加されない酵素でPCRをします。プライマーをリン酸化するかしないか、するならいつか、ベクターを脱リン酸化するかしないか、はどこかの議論を見てください。

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No.1041-1 - 2011/10/10 (月) 20:10:24 - ゆずゆ

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