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(無題) 削除/引用 No.1039-7 - 2011/10/10 (月) 20:42:21 - 千差万別かと シリウスさん、カイさん、ありがとうございます。 私も、リン酸化蛋白で量的な疑問があり、、、、結局流しなおすことを仕方なくしました。その場合、トータルの量は変わりませんでした。注意がいるようです。ストリッピングなし、エピトープの完全にちがうマウス由来とウサギ由来２重染色では(別のたんぱく質ですが）こういった疑問をかんじることなくうまくいっている(ような気がする）のですが。

(無題) 削除/引用 No.1039-6 - 2011/10/10 (月) 19:45:56 - カイ 余談ですが、シリウスさんのと同じような状況（リン酸化されたタンパクのバンドが濃いほうがトータルのタンパク質は少なく出た）が、Aktで起きて、 ストリッピング後も一次抗体がまだべたべたくっついてマスクしてるからトータルのほうを認識する一次抗体が結合できないんじゃないか と友人が言っていました。 (一度目に使った二次抗体はストリップではがれている…ということなんでしょうね。） メンブレンとタンパクの結合、タンパクと一次抗体の結合、一次抗体と二次抗体の結合を考えると、ストリッピングでどこの部分がはがれて落ちたかはタンパクによるし抗体によるでしょうから、一概には言えないですが、 リン酸化されたタンパクのバンドが濃いほうがトータルのタンパク質は少なく出るということは往々にして起こりうるんだなぁと。 私はAktでもErkでもそういうことはなかったので使ってる抗体にもよるんだろうと思います。

(無題) 削除/引用 No.1039-5 - 2011/10/10 (月) 09:59:16 - シリウス 少し状況がわかりました。 ＞時間以外はほぼ、シリウスさんと同じ条件でやっておりますが、時間が長い場合(４０分ほど）はシグナルが落ちすぎました。短い場合（１５分ほど）は前の抗体が取れませんでした。それぞれの抗体にもよるかと思っています。 発現量が少ないタンパク質（例えば、強制発現ではなく、内在性のタンパク質）は、一度、stripping操作が入ると、シグナルが落ちます。 もし、同じメンブレンを使って、いくつかのタンパク質を検出したいのでしたら、発現量の低いと思われるタンパク質から順に見ていく必要があると思います。 ただ、普通、自分が確認したいタンパク質から検出するので、なかなか、この通りに出来ないとは思いますが。 私は、論文用のデータ取りの場合、コストはかかりますが、別々に泳動して、目的タンパク質の発現を確認しています（きれいなデータが取れますし）。 同一のメンブレンで解析が必要な場合は、stripping後、シグナルが落ちることを念頭において、検出感度が極めて高いECL試薬（Thermo、WAKO、GEなどで販売）を使っています。 余談ですが、ERK1/2のリン酸化を検出していたときに、感じたことがあります。 リン酸化レベルの異なるERK1/2(phospho ERK1/2)を検出した後、strippingし、total ERK1/2を見たのですが、強くリン酸化されていた方のtotal ERK1/2のシグナルが弱くでる傾向がありました。 もちろん、loading control(GAPDH)のシグナルは同じです。 沢山、抗体が結合すると、strippingの時に、抗体と一緒にタンパク質も剥がれてしまうのかなと感じました（全く個人的な見解です）。 お役に立てば、幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1039-4 - 2011/10/10 (月) 05:49:20 - 千差万別かと シリウスさん、ありがとうございます。 時間以外はほぼ、シリウスさんと同じ条件でやっておりますが、時間が長い場合(４０分ほど）はシグナルが落ちすぎました。短い場合（１５分ほど）は前の抗体が取れませんでした。それぞれの抗体にもよるかと思っています。 yyyさん、ありがとうございます。 100% methanolで15-20分振盪するというのは、ほかにSDSなどで処理しないでもよいということでしょうか？　面白そうなので試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1039-3 - 2011/10/10 (月) 02:05:07 - yyy 100% methanolで15-20分振盪するというのも結構効果的で失敗が少ないです。 その後はＴＢＳＴなどで残ったメタノールを除いて、ブロッキング無しに1次抗体処理できます。 　 比較的穏やかな条件なのでたまに残ることがあって、特にECL+の蛍光物質（燐光物質でなく）は時間が経つと取れなくなって残る場合が多いですが、蛍光スキャンするのでなければ大きな問題にはなりません。

(無題) 削除/引用 No.1039-2 - 2011/10/09 (日) 22:46:44 - シリウス どのようにうまくいかないのでしょうか？ 私は、stripping buffer(62.5 mM Tris-HCl(pH 7.0), 2% SDS)を予め50℃に温めておいて、用時、1% 2-MEを加えてから、strippingに使用しています。 strippingは、50℃、30分で、ゆっくりと振とうさせています。 一般的な方法だと思いますが、問題なく、stripping出来ています。 ご参考になれば、幸いです。

ウエスタンの抗体のストリッピングのコツ 削除/引用 No.1039-1 - 2011/10/09 (日) 22:19:32 - 千差万別かと 抗原抗体反応に基づくので、千差万別かと思いますが、ある程度お勧めの手法を教えてください。 当方、ほとんどうまくいったことがありません。主に、SDSと２ーMEを含む液で５０度、15分ほどストリッピングをしております。

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