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PGC-1a抗体 トピック削除
No.1028-TOPIC - 2011/10/07 (金) 02:24:54 - 悩み中
いつもこのフォーラムで勉強させて頂いています。

現在私は、C2C12細胞やマウスのヒラメ筋の抽出液から、
PGC-1aをIPしてrabbitのAc-K抗体(Cell Signaling)でアセチル化を検出する実験を組んでいます。

これまで色々なPGC-1a抗体を試したのですが、
そもそも抽出液のWBで検出されるバンドの位置がそれぞれで異なります。
各抗体の添付文書を見ても記載されているサイズは全く異なっています。

PGC-1aを強制発現させた293T Lysateの市販品を購入して、
各抗体でWBすると約130kDaにバンドが出るので、
おそらくこれがPGC-1aなんだろうとは思っています。

AbnovaのPAB7302という抗体が内在性の130kDaタンパク質を検出出来ます。
しかし、この抗体は85kDaタンパク質も認識します。

この抗体を用いてIP&WBを行なったところ、
C2C12抽出液では130kDaと85kDa、マウス筋では85kDaのタンパク質がIPされています。
どちらの場合も85kDaタンパク質はかなり効率よくIPされています。
ちなみにIP後にAc-K抗体でWBを行なっても、130kDa、85kDaのタンパク質のアセチル化は検出出来ません。

長くなりましたが質問させて下さい。

@PGC-1aを扱っている方は、電気泳動した時のPGC-1aのサイズがどれくらいだと認識していますか？
A内在性PGC-1aのWBまたはIPに用いる事が出来る抗体を教えて下さい。
BもしPGC-1aのサイズが130kDaだとしたら、85kDaタンパク質は分解物でしょうか？何か心当たりはありませんか？

どうぞよろしくお願い致します。
　
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ありがとうございます。 削除/引用
No.1028-4 - 2011/10/17 (月) 00:42:49 - 悩み中
お二人ともありがとうございました。
またお礼を言うのが遅くなってしまい申し訳ありませんでした。

マウスを寒冷刺激するというのは良いアイデアだと思いました。
今後、計画してみようと思います。

AB3242抗体は私も使った事があり、
確かに100kDa位のバンドがバシッと出ます。
しかし、PGC-1aを強制発現させた293T Lysateを用いてWBを行なうと、
どの抗体でも130kDaのバンドがかなりの濃さで出る事から、
PGC-1aの本当のサイズは130kDaに違いないと思ってしまっています。
一番最初にAB3242を買っていれば疑わずに使っていたような気もしますが。。

このような経験がこれまでになく混乱していますが、
今後もいろいろ検討していこうと思います。

どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.1028-3 - 2011/10/09 (日) 01:19:23 - み
マウスが使用できる環境にあるようなので、マウスを寒冷暴露して褐色脂肪でのPGC-1aの発現上昇をポジコンに使用すれば良いでしょう。

chemicon社AB3242を抗体使用していましたがシングルバンドで強烈なバンドが出ていたと記憶します。
サイズは覚えていませんがデータシートと同じくらいのバンドが出ていたので疑いはしませんでした。ちなみにデータシートには100kDaと記載されています。

(無題) 削除/引用
No.1028-2 - 2011/10/07 (金) 09:10:37 - 脂肪
私自身の経験でなくて申し訳ないのですが、以前に同僚が質問者さんみたいなことで悩んでて、結局PGC-1aの発見者のラボに尋ねてました。
記憶があいまいで申し訳ないのですが、確か９０〜１００ｋＤａくらいだった気がします。

PGC-1a抗体 削除/引用
No.1028-1 - 2011/10/07 (金) 02:24:54 - 悩み中
いつもこのフォーラムで勉強させて頂いています。

現在私は、C2C12細胞やマウスのヒラメ筋の抽出液から、
PGC-1aをIPしてrabbitのAc-K抗体(Cell Signaling)でアセチル化を検出する実験を組んでいます。

これまで色々なPGC-1a抗体を試したのですが、
そもそも抽出液のWBで検出されるバンドの位置がそれぞれで異なります。
各抗体の添付文書を見ても記載されているサイズは全く異なっています。

PGC-1aを強制発現させた293T Lysateの市販品を購入して、
各抗体でWBすると約130kDaにバンドが出るので、
おそらくこれがPGC-1aなんだろうとは思っています。

AbnovaのPAB7302という抗体が内在性の130kDaタンパク質を検出出来ます。
しかし、この抗体は85kDaタンパク質も認識します。

この抗体を用いてIP&WBを行なったところ、
C2C12抽出液では130kDaと85kDa、マウス筋では85kDaのタンパク質がIPされています。
どちらの場合も85kDaタンパク質はかなり効率よくIPされています。
ちなみにIP後にAc-K抗体でWBを行なっても、130kDa、85kDaのタンパク質のアセチル化は検出出来ません。

長くなりましたが質問させて下さい。

@PGC-1aを扱っている方は、電気泳動した時のPGC-1aのサイズがどれくらいだと認識していますか？
A内在性PGC-1aのWBまたはIPに用いる事が出来る抗体を教えて下さい。
BもしPGC-1aのサイズが130kDaだとしたら、85kDaタンパク質は分解物でしょうか？何か心当たりはありませんか？

どうぞよろしくお願い致します。
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