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正常細胞のRNA収量を増やしたい トピック削除
No.1023-TOPIC - 2011/10/06 (木) 19:29:08 - 一年生

はじめまして　よろしくお願いします。

私は正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)のRNA抽出を行い、その後RT-PCRを行っています。

6cm dish に細胞を播き、QIAGEN kit　を用いて抽出を行っています。

初めのころは収量が500〜1000ng/µlくらいあったのですが、ここ2、3カ月は収量が100〜300ng/ml と激減してしまいました。また、RNAのクオリティーも確実に落ちています。

やり方はプロトコル通りに行っており、何も変えていません。
なぜだかわからなくて途方に暮れています。
もしよかったら何かアドバイスをいただけたら嬉しいです。
よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.1023-5 - 2011/10/18 (火) 16:36:35 - ~
>細胞継代数は3回で、いつも一定にしております。
これは、primaryから取っていて、そこから数えて3継代なのでしょうか？
それとも、凍結ストックを起こしてから3継代なのでしょうか？

前者をできるラボはそうそう無いと思いますが、やっているのでしたら、サンプリングの仕方が細胞の生きに影響を与えるでしょう。
ヒト相手に毎回同じ操作は出来ていないと思います。

後者であれば、凍結ストックを作る前の継代数が影響するかもしれません。
起こしてからの継代数だけでなくPDLでの管理も行なったほうがいいと思います。

>後は考えられるのは温度でしょうか。
サンプルの確認が先だと思いますが、
私が書いた温度は炭酸インキュベーター等の温度のつもりです。

(無題) 削除/引用
No.1023-4 - 2011/10/18 (火) 15:53:13 - 一年生
御返事が遅くなってしまいすみません。

皆様、親切な回答ありがとうございました。


細胞継代数は3回で、いつも一定にしております。


RNAのキットや試薬もすべて新しくしたものを使用したのですが、
やはりRNA量は低いです。

後は考えられるのは温度でしょうか。
もちろん器具や細胞は冷やしながら作業を行っているのですが、
夏にかけて室温も上がり温度差による影響も原因の一つでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.1023-3 - 2011/10/08 (土) 19:17:16 - シリウス
＞一年生 さん

＞私は正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)のRNA抽出を行い、その後RT-PCRを行っています。
＞初めのころは収量が500〜1000ng/µlくらいあったのですが、ここ2、3カ月は収量が100〜300ng/ml と激減してしまいました。また、RNAのクオリティーも確実に落ちています。

初代培養系で、継代数も限られている細胞でしょうか？
もし、そうであるなら、RNA収量が継代するにつれて、
減少してきても不思議ではありません。
メーカーからの購入品でしたら、保障継代数の範囲の
現象かどうかが重要になってきます。

RNAのクオリティーは、260nm/280nm比のことですか？
RNA収量が減れば、必然的に260nm/280nm比は下がりますよね。

メーカーから購入したヒト正常初代細胞を培養したとき、
継代数が増えてくると、増殖速度が落ちてきて、最終的に
殆ど増えなくなった経験があります（RNA量は測定していませんが）。

ご参考になれば、幸いです。

(無題) 削除/引用
No.1023-2 - 2011/10/07 (金) 09:16:53 - ~
まず手を付けるのは、
全ての材料、試薬を問題の無いことが確認できるものに交換し、
機器等のパラメーターを確認することだと思います。

細胞自体
　起こしなおす
細胞培養部分
　培地（ウシ血清を含む）を新しくする
　播種密度、回収時の細胞密度、タイムコースを確認してみる
RNA抽出試薬
　新しいものに変えてみる
RNA抽出後
　RNAを溶かす溶媒を確認する
機器全般
　温度設定を確認する

正常細胞のRNA収量を増やしたい 削除/引用
No.1023-1 - 2011/10/06 (木) 19:29:08 - 一年生

はじめまして　よろしくお願いします。

私は正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)のRNA抽出を行い、その後RT-PCRを行っています。

6cm dish に細胞を播き、QIAGEN kit　を用いて抽出を行っています。

初めのころは収量が500〜1000ng/µlくらいあったのですが、ここ2、3カ月は収量が100〜300ng/ml と激減してしまいました。また、RNAのクオリティーも確実に落ちています。

やり方はプロトコル通りに行っており、何も変えていません。
なぜだかわからなくて途方に暮れています。
もしよかったら何かアドバイスをいただけたら嬉しいです。
よろしくお願いします。
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