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お礼２ 削除/引用 No.913-6 - 2008/04/06 (日) 21:10:59 - HIS-TAT+ ats様 大変参考になります。 皆様に助言いただいたことを、ひとつずつ試していきたく存じます。 うまくいったら（いかなくても）報告させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.913-5 - 2008/04/05 (土) 19:17:40 - ats Hisタグカラムに結合させた状態で、徐々に（10カラムVol以上でゆっくり）尿素濃度を下げていきフォールディングさせる方法もあります。うまくいくかどうかはタンパク・条件によりますが、タンパク同士が絡んで不溶化しないのでフォールディングしやすいという理屈らしいです。Arg、GlyはHisタグとカラムの結合を阻害するので、フォールディング補助剤としては使えません。

お礼 削除/引用 No.913-4 - 2008/04/04 (金) 21:22:56 - HIS-TAT+ 早速のアドバイスありがとうございます。 実は白精製はこれまでにしたことがなく、Current Protocol in Cell Biologyの記載にしたがってやっていました。 なぜイオン交換カラムを通すと可溶性になるのか、個人的にはわかりかねますが、８M尿素を薄めて４M尿素にするとイオン交換カラムに結合するとProtocolにあり、そのようにいたしました。 ”Aさん”のおっしゃるようにたしかに、尿素入りサンプルを急に尿素なしバッファーで薄めるのはよいアイデアかもしれず、試してみたく思います。 透析で尿素を徐々に抜く手は最初に試しましたがダメで、蛋白が凝集・沈殿してしまいます。protocolにも、透析はほとんどの場合ダメである、と記載されています。 ”りょう”さんご指摘のように、現在誘導温度を下げて、nativeの条件で精製することを試みています。

(無題) 削除/引用 No.913-3 - 2008/04/04 (金) 02:13:16 - A 読んだ限りでは蛋白が巻き戻っていない為凝集しやすいのでしょう。 PD10で尿素を除くだけでは駄目でその前にリフォールドのステップを 入れる必要があるのでしょう。イオン交換カラムのくだりが今ひとつ ピンと来ないのですが尿素を含む溶液をイオン交換カラムにのせたの ですか？もしそうなら原理的に尿素は蛋白質とカラムの電気的な相互 作用を妨げるはずですから何も溶出されなかったというのはカラムが フィルターの様な働きをして蛋白質がカラムに詰まったのでしょう。 リフォールディングですが一番最初にやってみるべきは現在サンプルが 溶けている溶液から尿素を除いたバッファーで急激に薄めることです。 これによってリフォールドがある程度起こるはずでもし上手くリフォールド せずに凝集しやすい状況でも薄まっていますから多くは凝集しないはずです。この状況で４度で一晩置いて、上清にあると思われる目的蛋白質を 回収、濃縮します。他の方法は透析で段階的に尿素を抜いたり、CMCの 小さな界面活性剤・アミノ酸（Arg、Gly、Proなど）・他の高塩溶液（NaCl,KClなど）などを添加してリフォールドを助けるなどの方法が 使われます。

(無題) 削除/引用 No.913-2 - 2008/04/03 (木) 23:10:27 - りょう periplasmに分泌されるようなベクターに入れ替える。 大腸菌ホストを変える（オリガミとか修飾した菌が色々ありますよね）。 誘導温度を２５度などに下げる。 ure, guanigineを使用しない抽出条件を検討する（塩濃度は0.3−0.5MくらいにあげてもHis-tag精製なら大丈夫でしょう）。 Q, S-columnは強イオン交換でしたっけ？DEAEなど弱いものに変える。 疎水カラムの適用は無理でしょうか(脱塩も兼ねられるかも）？ 細胞にふりかける目的なら基本的に非変性条件で精製した方が良いでしょう。あとエンドトキシンの影響が出ないか心配です。 頑張ってください。

Hisタグ-TAT-fusion蛋白の精製 削除/引用 No.913-1 - 2008/04/03 (木) 22:54:20 - HIS-TAT TATとの融合蛋白をHisタグをつけて大腸菌に発現させて精製しています。 原理的にはTAT−融合蛋白を細胞に振りかけるとこの蛋白は細胞内に入っていくので目的の蛋白を細胞内に発現させることが可能なはずで、これを目的にしています。しかし、Hisタグ-TAT-目的蛋白の融合蛋白を大腸菌に発現させると不溶性画分にいくため８M尿素を用いた変性条件で精製しました。これを、PD10カラムにかけて尿素を除くと蛋白が凝集して水不溶性になり、細胞培養液に添加しても目的を達せません。こういう場合には、イオン交換カラムを通して精製し、高濃度NaClで溶出した後にPD10カラムで脱塩するとうまくいく場合が多いという文献があり、そのように実行しましたが、だめです。1M-2MのNaClで溶出できないのです。Q,SPの陽陰、開始バッファーのpHやNaCl濃度などいろいろ変数を変えてみましたが、その限りではどうもイオン交換レジンとHisタグ-TAT-融合蛋白が不可逆的に結合するように思えます。文献を読むと、確かにこのような場合がまれにあるとあります。しかし、その解決法は記載されておりません。どなたか、よい知恵をお授けくださいませんか、よろしくお願いします。

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